猪牛肉掺假鉴定技术及其特异性物质研究进展

杜洪振，赵欣欣，陈倩，孔保华

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

猪牛肉掺假鉴定技术及其特异性物质研究进展

杜洪振，赵欣欣，陈倩，孔保华*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

目前肉品掺假现象层出不穷，这些掺假制品通过感官判断很难区分真伪。研究表明一些现代分析技术通过检测肉的特异性物质能够鉴定肉的种类。本文主要以猪肉和牛肉为例，以其内在存在的种间特异性差异，从蛋白质和基因等角度分别论述各种肉的特异性物质，为肉制品掺假鉴定提供一定参考的依据。

蛋白质；基因；掺假；鉴定技术；特异性物质

原料肉的掺假问题目前是研究人员、消费者、肉类行业以及各方面决策者最关心的问题之一。近年来由于各种危害公众安全健康事件的爆发，如禽流感、猪流感和三聚氰胺等事件，使得人们对食物的要求已从单纯的好吃转变成要吃的放心、安全。一些生产者受利益的驱动，通过掺假来获得非法利润，如2013年在欧洲原料牛肉中检测到马肉事件[1]，2014年沃尔玛济南泉城分店销售的“五香驴肉”被检出含有狐狸和貉肉的成分[2]，2015年上海市查处鸡肉染色变牛肉事件[3]。掺假的方法包括在食品中使用低价值原料替代高价值的原料，减少高价值原料的使用量，通过添加成本较低的成分以保证较好的产品外观，以及在产品中使用虚假或误导性标签。多数情况下，肉品掺假都是受商业利益的驱使，为了经济目的的故意掺假。而这些掺假制品往往集中在熟食店里的熟食和包装熟食、香肠制品、汉堡饼、肉馅、宠物食品、罐头肉以及贴错标签的肉类产品[4-10]。

目前原料肉掺假鉴定技术主要是基于核酸序列，蛋白质或多肽，脂肪和光谱的鉴定，其中基于脂肪和光谱鉴定，如三酰甘油分析[11]和近红外光谱[12]等技术使用较少，本文不再论述。原料肉的不同加工方式是造成肉品掺假鉴定困难的关键问题，而与鉴定方法的原理无关。因此可利用DNA或蛋白质技术通过物种的特异性鉴定原料肉和加工肉制品是否为掺假肉。甚至还可以通过DNA分析鉴定特定的物种。虽然在肉产品中检测未申明的肉相对简单，但是掺假肉中掺假量的表示问题一直尚未解决，故可以通过重量/重量来表示其含量[13]。近十几年中随着大众消费意识的提高以及宗教信仰问题的日益凸显，对原料肉和肉制品的安全以及肉类行业提出了更高的要求。许多学者致力于研究和开发新的技术和方法鉴定物种的来源。因此，本文对肉制品掺假技术原理和应用，以及目前所鉴定出的猪牛肉特异性物质进行综述。

1 基于蛋白质的鉴定技术及所鉴定的特异性蛋白质

肉制品蛋白含量丰富，肌肉中除水分外主要成分为蛋白质，其中牛肉、羊肉、猪肉以及鸡肉蛋白质含量分别为20.8%、20.3%、21.1%和23.1%[14]。从营养角度来说，肉是必需氨基酸的重要来源，其中牛肉中亮氨酸，赖氨酸和缬氨酸含量比猪肉、羊肉稍高，而苏氨酸含量略低，且不同种类动物肌肉中组氨酸二肽比率差异较大，因此可以利用这些差异进行物种鉴定[15]。目前基于蛋白质检测技术鉴定肉品特异性物质的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳法[16]，免疫印迹法[17]，高效液相色谱法[18]，酶联免疫分析法[19]以及采用蛋白组学分析的方法[20]。

1.1 基于特异性蛋白质的鉴定技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳法广泛应用于分离蛋白质的亚基和测定未知蛋白质的分子量。当向样品中加入SDS（Sodium dodecyl sulfate）和 β-巯基乙醇后，蛋白质分子解聚成多肽链并与SDS结合生成蛋白质-SDS胶束，从而带上较多的负电荷，这就消除了蛋白质分子间的电荷和结构差异。其原理是利用分子量大小不同的蛋白质在凝胶中迁移率的不同，从而将不同蛋白质分开，这种方法通常适用于熟制品如商业香肠制品[21]。

免疫印迹法是一种将凝胶电泳的高分辨率与免疫学分析的高特异性相结合的高灵敏度和高分辨率的检测技术。其原理是利用凝胶电泳的分离筛效应将混合的蛋白质分离，再利用抗原-抗体相互作用，识别特定蛋白质，然后经过显影识别结合抗体的抗原。免疫印迹法是常用的检测蛋白质的特性、表达情况以及分布范围的技术。通常用于加热/高压灭菌肉样的物种测定和鉴定，可选用商业试剂盒中的抗体对加热/高压灭菌的肉样品进行鉴定[22-23]。因此，在分析之前需要对生肉样品进行加热或高压灭菌。

肉制品中蛋白质的检测并不局限于免疫测定。还包括高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）。高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，通过以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂和缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。通过液相色谱的方法已经检测并绘制了多种蛋白质的图谱，其中还包括各种动物物种肉来源肉制品的蛋白质图谱[24-25]。目前，用于反刍动物的高效液相色谱法，主要集中在动物特定的组氨酸肽、肌肽和鹅肌肽的检测，而且鲸肌肽的检测可以达到0.5%或更高的灵敏度[26-27]。

酶联免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物的颜色反应和产物的量与标本中受检物质量关系，进而通过判断颜色的深浅进行定性或定量分析。测定的对象可以是抗体，也可以是抗原。ELISA技术的一般优点是可以在现场实施用于物种测定，并且可以在约15 min内获得结果[23]。Chen[28]和Liu[29]等以单克隆抗体建立的ELISA方法对猪的热稳定性肌肉蛋白进行鉴定，结果表明不同来源的肉类混合物中猪肉的检测限为0.5%～0.05%。

此外，蛋白组学分析的方法也可以用于肉制品中特异性蛋白质的检测。蛋白质组定义为一个基因组、一种生物或一种细胞或者组织在某一特定时期所表达的全套蛋白质[30]。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病和药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。Lametsch等[31-32]利用蛋白质组学技术采集分析了宰后0、4、8、24、48 h的猪肉蛋白样品，这些蛋白质分子量在5 kDa～200 kDa不等，pH值在4～9之间，最终确认了可作为标记的20多种蛋白质，包括肌动蛋白质、肌球蛋白质、肌钙蛋白T以及丙酮酸激酶。

1.2 牛肉鉴定出的特异性蛋白质

牛肉肌红蛋白含量高，且鲜切面氧合速率慢，故而肉色深[15]。Kim[17]等通过蛋白标记，特异性的鉴定出牛肌钙蛋白的氨基酸序列在85位处为精氨酸，而猪肌钙蛋白在此处为赖氨酸。此外，Montowska[33]在2012年比较了6种动物肌球蛋白轻链1和肌球蛋白轻链3，发现牛肉、猪肉和火鸡肉所在位点均不相同，而肌球蛋白轻链2出现重叠，但是各物种的肌球蛋白轻链2分子量和等电点差异很大，因此可以通过标记牛肉肌球蛋白轻链1、2和3鉴定出牛肉和猪肉。同样Montowska[34]在2013年报道中称牛肉2-DE结果中标记一个为B476的点，通过和火鸡2-DE结果中一个为T587的点比较发现，两者均为血清白蛋白，且两者分子质量类似，但是等电点不同，牛肉的血清白蛋白等电点为5.88，而火鸡血清白蛋白等电点为5.56。此外，Negishi[35]研究了牛肉中肌钙蛋白的特性，发现肌钙蛋白C、I和T的分子量分别为19 500 Da、23 300 Da和40 400 Da。这就表明通过分析牛肉中肌钙蛋白C、I和T的分子量能够鉴定牛肉。

1.3 猪肉鉴定出的特异性蛋白质

猪肉因蛋白质含量丰富且价格低廉深受广大消费者喜爱。除穆斯林教徒和犹太教教徒不能食用以外[36]，猪肉蛋白已经成为广大消费者获得动物类蛋白的主要途径。Liu等[29]利用猪肌钙蛋白I作为抗原，通过夹心酶联免疫分析法制作了两种特异性抗体MAbs 8F10和5H9，能够检测出牛肉中的猪肉，且最低检测值为0.1%。而Sarah[37]通过液质联用鉴定出熟猪肉的4条特异性多肽（EVTEFAK,LVVITAGAR,FVIEIR和TVLGNFAAFVQK）。Lametsch 等[38]通过标记 18 个 2-DE上的点最终确定了9种蛋白质作为猪肉宰后变化的标识物，它们分别是肌动蛋白，肌球蛋白重链，肌钙蛋白T以及肌酸激酶，磷酸丙酮酸水合酶，肌激酶，丙酮酸激酶和二氢硫辛酰胺转琥珀酰酶。此外，Kim等[17]通过标记牛肉和猪肉的肌浆蛋白电泳条带发现了一条猪肉特有的条带，经过鉴定为葡萄糖六磷酸异构酶。

2 基于核酸的鉴定技术及鉴定出的特异性核酸序列

蛋白质是基因表达的结果，它包含了有关蛋白质的组成和结构的信息。近年来DNA技术发展的同时也促进了鉴定原料肉和肉类产品真实性研究的发展。基因稳定性高，且大部分组织细胞中均含有物种所含有的全部基因。基因鉴定需要的样品数量少，而且可以鉴定经过高温处理后的样品。当样品不具有代表性时，提取的目标DNA相对于提取的DNA总数量而言可能很少，在这种情况下，DNA的提取尤其重要。因此需要选择合适的目标基因，高效的DNA提取方法，以及高灵敏度的检测方法[39]。另外，某些物质也可能抑制PCR反应的过程，如糖原、脂肪乳蛋白、胶原蛋白、多糖以及美拉德反应的产物。这就需要良好的提取方法能够在提纯过程中除去这些抑制物[40]。目前通过鉴定核酸进行特异性物种识别的技术主要有，荧光定量PCR法[41-43]，随机扩增多态性DNA标记-PCR法[44]（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）,种属特异性PCR法[45]，多重PCR检测法[46]和PCR-限制性片段长度多态性法[47]。

2.1 基于特异性核酸的鉴定技术

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并通过软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光染料是指双链DNA的小沟结合的染料。当与双链DNA结合时，荧光染料具有很强的荧光，而未结合的却没有，且荧光强度与双链DNA的量成比例。荧光探针结合在正向和反向引物之间，并且包含连接到5′端的荧光团和连接到3′端的猝灭剂。在PCR期间，Taq酶的5′端-3′端外切核酸酶的活性将探针酶切降解，使荧光团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光并利于随后的检测。该方法虽然价格昂贵，但是能百分百鉴定物种，是一种特异性很强的鉴别方法。

RAPD是建立在PCR基础上的一种对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术，其基本原理与PCR技术一致。物种特异性PCR方法是针对不同物种的差异性序列设计引物，利用短的任意引物产生一系列扩增产物，从而实现从复杂基质中较为灵敏地将目的片段进行扩增并进行成分鉴别的目的。RAPD不仅可以用于家畜的检测，还可以用于珍稀动物的检测，而不需要预先了解DNA序列。该方法准确、快速、简单、方便，但属于非特异性反应，易受样品中其他物种DNA的干扰，因此不能进行混合样品的鉴别。

种属特异性PCR法是针对不同物种的差异性序列进行设计引物，从而实现从复杂基质中较为灵敏地将目的片段进行扩增并进行成分鉴别的目的。该方法的优点是无需对产物进行测序，且适用于混合样品的检测。

多重PCR是聚合酶链反应的修饰，其同时扩增许多不同的DNA片段，与简单PCR相比，其能够在短时间内快速检测多种物质。而且，它更便宜且省时省力。然而在同一个管中同时使用多个PCR引物可能会引起一些问题，如产生错误引物的PCR产物以及引物二聚体的增加等问题。

PCR-RFLP （Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术已经被用来作为物种特异鉴定技术。PCR扩增产物经过酶切和凝胶电泳可视化可作为单一物种的特有模式。RFLP分析物种的分化依赖于限制酶识别的特定的酶切位点，且错误的结果可以在限制性酶切位点随机发生点突变，因此应该谨慎操作。事实上，限制性酶切位点的点突变可能是有利的，因为它可以区分关联比较密切的DNA，如区分不同物种之间的牛[49]。

2.2 牛肉鉴定出的特异性核酸序列

Feligini[49-50]等使用牛特异性PCR引物，以COI基因序列为基础，对奶牛进行定性和定量鉴定。李杰[51]等应用牛和猪线粒体序列特异性引物进行PCR扩增，只有牛肉和猪肉基因组DNA样品能扩增出214 bp和431 bp的目的条带，其它肉品对照基因组DNA以及阴性对照均没有扩增产物出现。张国利等[52]对所提取的生鲜牛肉、煮熟牛肉和高压牛肉的DNA进行PCR扩增，引物Ⅰ5′-TGT ACGAAGAAATGTGCGG-3′，位置1 641～1 659；引物Ⅱ5′-TCAATGCAAAGGACAAGC－CTGC-3′，位置 1858～1837；通过扩增均能得出 218 bp的目的DNA条带，而猪、马、羊、鹿、骆驼等15种动物的DNA则不能扩增出该条带。Spychaj等[53]以COI基因序列作为杂交对象，以BTCOIF11和BTCOIR11作为引物，引物序列为5′-GAACTCTGCTCGGAGACGAC-3′和 5′-GGTACACGGTTCAGCCTGTT-3′，PCR产物大小为255 bp成功鉴定出牛肉，且能100%鉴定。Girish等[54]通过分析线粒体12S rRNA基因序列可以鉴定肉的种类。扩增12S rRNA基因的引物序列为正向 5′-CAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′和反向 5′-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3′。

2.3 猪肉鉴定出的特异性核酸序列

Spychaj等[55]以COI基因序列作为杂交对象，以BTCOIF11和BTCOIR11作为引物，引物序列为5′-GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3′和 5′-TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3′，PCR产物大小为294 bp鉴定出猪肉，且鉴定率为100%。Saez等[52]采取RAPD-PCR的方法，选择以OPL-04和OPL-05作为引物，引物序列分别为 5′-GACTGCACAC-3′和 5′-ACGCAGGCAC-3′。分析结果表明6组之间具有82%的相似性，且至少共享了3组从1.0 kbp至0.6 kbp的强烈谱带，从而可以将猪肉和其他肉分开。Mane等[56]使用基于线粒体16S rRNA基因设计特异性引物，成功地优化PCR测定以扩增从猪肉提取的263 bp DNA片段。优化后的PCR测定随后用于检验黄牛肉、水牛肉、绵羊肉、山羊肉、猪肉和鸡肉提取的DNA片段，发现引物对猪肉的识别具有特异性，并且没有观察到交叉反应。随后从热处理的肉和肉糜中提取DNA片段，经过PCR扩增，没有发现热处理的不利影响。Che等[57]采用物种特异PCR法，以12SFW和12SR为引物，引物序列分别为5′-CCACCTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-3′和 5′-GTTACGACTTGTCTCTTCGTGCA-3′，以 12S rRNA 作为目标基因，经过PCR扩增产生了针对猪肉香肠的387 bp的条带，并且没有产生非特异性扩增产生的片段。

3 结论

以上综述了研究人员近年来对猪肉和牛肉肉品源追溯鉴别所使用的方法以及所鉴定的特异性物质。目前，各种基于蛋白质的鉴定技术，例如免疫印迹和高效液相色谱技术，已经能很有效地鉴别大部分常规肉制品，但对于高温肉制品的掺假鉴定还存在不足之处。而大多数生物组织中存在DNA分子，且在高温下具有相对高的稳定性，使得它们成为食品组分鉴定最合适的分子。但是基于DNA分析的方法还没有开发出专门检测物种特异性物质的技术，而且现有的检测技术还需要进一步提高灵敏度。希望在不久的将来能开发出高灵敏度，快速，价格低廉，并且能够分析热加工肉和原料肉的鉴定技术。

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《食品研究与开发》是由天津市食品研究所有限公司和天津市食品工业生产力促进中心主办，国内外公开发行的食品专业科技期刊，1980年创刊，半月刊，采用国际流行开本大16开。其专业突出，内容丰富，印刷精美，是一本既有基础理论研究，又包括实用技术的刊物。本刊已被“万方数据库”、“中文科技期刊数据库”、《乌利希期刊指南》、美国《化学文摘》、英国国际农业与生物科学研究中心（CABI）、英国《食品科技文摘》（FSTA）等知名媒体收录，并被列入“中文核心期刊”、“中国科技核心期刊”、RCCSE中国核心学术期刊（A）。主要栏目有：基础研究、分离提取、研发与工艺、标准与检测、生物工程、营养保健、贮藏保鲜、质量安全、专题论述、食品机械等。

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Advances in Adulteration Identification Techniques and Specific Substances of Pork and Beef

DU Hong-zhen，ZHAO Xin-xin，CHEN Qian，KONG Bao-hua*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The phenomenon of adulteration in meat and meat products is an important quality and safety problem，and meat products produced by adulterated material is difficult to identify and distinguish by sensory evaluation.Some of the modern analysis technology can identify meat types by detecting meat-specific substances.In this paper，the specific substances in the pork and beef was reviewed by protein and gene identification technology in order to supplying some technical basis for identifying the adulteration in meat products.

protein；gene；adulteration；identification technology；specific substances

2017-02-19

国家重点研发计划项目（2016YFD0401504）；黑龙江省应用技术研究与开发计划（GA15B302）

杜洪振（1991—），男（汉），硕士研究生，研究方向：畜产品加工工程。

*通信作者：孔保华（1963—），女（汉），教授，博士生导师，研究方向：畜产品加工。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.043