喉组织中相关特异性蛋白异常的表达及临床意义

曾汉荣，杨虹女，李文星，涂兴，孔维佳

(1.枝江市人民医院耳鼻咽喉科，湖北 枝江 443200；2.华中科技大学同济生命科学学院，湖北 武汉 430022)

喉组织中相关特异性蛋白异常的表达及临床意义

曾汉荣1，杨虹女1，李文星2，涂兴2，孔维佳2

(1.枝江市人民医院耳鼻咽喉科，湖北 枝江 443200；2.华中科技大学同济生命科学学院，湖北 武汉 430022)

目的探讨喉组织中相关特异性蛋白异常的表达及其临床意义。方法所有病理标本来源于2012年5月至2015年2月间我院耳鼻咽喉头颈外科因喉部不同病因需要接受手术治疗住院患者，其中，喉癌组织标本(喉癌组)、喉声带息肉组织标本(息肉组)和喉癌前病变组织标本(癌前组)各69例。喉癌标本按照2010年国际抗癌联盟(UICC)标准进行临床分期和病理分级。采用过氧化物酶标记链酶卵蛋白素染色法检测各组标本中人乳头状瘤病毒16E7蛋白(HPV16E7)和细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)表达水平。采用相关统计学分析和比较各组间HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率和相关性差异。结果喉癌组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达出现于细胞核，为大量黄褐色粗大颗粒，阳性表达率分别为44.93%和52.17%，明显强于息肉组(分别为2.90%和8.70%)和癌前组(分别为5.80%和23.19%)，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，癌前组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率较息肉组也明显提高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；在喉癌临床分期中，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率在Ⅰ～Ⅳ期中随着分期增加呈上升趋势(P＜0.01)；在喉癌病理分级中，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率随分化程度减弱，均表现为Ⅲ级＞Ⅱ级＞Ⅰ级(P＜0.01)；HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率与喉癌发生率均具有显著正相关(r=0.79、0.86，P= 0.003，0.002)，两者相互间阳性表达率也呈显著正相关(r=0.68，P=0.005)。结论喉癌的发生和发展与HPV16E7和Cyclin D1过度表达密切相关，因此，对HPV16E7和Cyclin D1检测有利于提高患者的临床早期诊断和生存预后。

喉癌；人乳头状瘤病毒16E7蛋白；细胞周期调节蛋白D1；阳性表达

喉癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤，占全部喉癌的96%～98%。人乳头瘤病毒(human papiloma-virus， HPV)感染是其发病的主要病因，并和细胞周期调控蛋白(cyclin)一道在LSCC发生中起着决定性作用[1]。作为一种致癌原癌基因病毒，HPV的高危型早期编码区E7基因及其编码核磷酸蛋白(HPV16E7蛋白)被认为与口咽喉肿瘤密切相关原癌基因。它通过干扰和加快喉组织中细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)过表达[2]，造成细胞周期循环途径中G1/S关卡(G1/S checkpoint)失控，喉组织细胞生长变得无序增加，出现严重未成熟和/或异常细胞，从而导致LSCC发生发展[3]。研究HPV16E7、Cyclin D1与癌生物学行为关系及其相关程度，有利于了解LSCC发生发展及其治疗方式。本实验将采用链霉卵白素-辣根过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)技术，检测临床上LSCC、声带息肉(vocal cord polyp，VCP)和喉癌前病变(laryngeal precarcinoma lesions，LPL)组织中HPV16 E7和Cyclin D1表达，旨在为临床了解LSCC发病机制和早期诊断及其基因治疗靶点提供实验数据和理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病理标本均来源于2012年5月至2015年2月间在我院耳鼻咽喉头颈外科因喉部不同病因，经术前电子喉镜、病变组织活检等确定需要接受手术治疗住院患者，最终经过病理科作HE染色，医师诊断得出相应结果并出具诊断报告。每一例病理组织离体后，迅速用生理盐水冲洗血迹，无菌手术刀在中心部位切取组织，置于10%中性福尔马林中固定，常规石蜡包埋，供HE和免疫组织化学染色。其中，喉癌组织标本(LSCC组)69例，来自行根治性手术部位，男性57例，女性12例，年龄42～79岁，平均(60.5± 12.3)岁；LSCC纳入标准：(1)既往无喉部手术史；(2)手术前没有接受任何放疗、化疗或免疫治疗；(3)不伴不典型增生；(4)无并发其他癌症及急、慢性病史；根据2010年国际抗癌联盟(UICC)标准进行临床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期24例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；按肿瘤分化程度分级：Ⅰ级(高度分化)24例，Ⅱ级(中度分化)33例，Ⅲ级(低度分化)12例。声带息肉标本(VCP组)69例，为本院同时期行声带息肉摘除住院患者；喉癌前病变标本(LPL组)69例，为喉角化病、喉黏膜白斑病、疣状增生等异常病灶需要住院进行手术根治患者[4]。VCP组和LPL组中病理材料来源时间、纳入标准、性别和年龄资料与LSCC组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)、具有可比性。对于上述所有标本均在实验前再次行HE染色，由3名经验丰富病理科医师对切片组织细胞形态学再次行病理学定性确诊。

1.2 主要仪器和试剂 脱水机、包埋机和切片机(Leica公司，德国)；生物学显微镜(BX-63，Olympus公司，日本)；图像获取数字分析系统(NIH Image 1.6，Kontronm公司，德国)；酶标仪(Synergy HF，Bio-tek公司，美国)；Western blot转移电泳仪(XCell SureLock，Invitrogen公司，美国)；双通道荧光扫描仪(ODY-2182，Li-Cor公司，美国)，紫外凝胶成像系统(VL，Vilber公司，法国)。兔抗人HPV16E7、Cyclin D1和GAPDH单克隆抗体均购自美国Epitomics公司；SP免疫组化测试盒、DAB-H2O2试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)、3%H2O2等购自基因生物工程有限公司；溴酚蓝、TBST缓冲液、脱脂奶粉均购自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 SP法检测蛋白表达 将各组标本经10%中性福尔马林固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋等步骤制成蜡块，后作连续切片，厚度为4 μm。每一个标本留取10张切片用作检测两种蛋白，每种蛋白5张。将各组待检测切片放入烤箱中烘烤、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，蒸馏水和PBS反复冲洗修复，3% H2O2液孵育后，滴加非免疫羊血清封闭去除血清。根据SP免疫组化测试盒上说明，分别在各组织切片上滴加稀释比例为1：100的Ⅰ抗兔抗人HPV16E7或Cyclin D1单克隆抗体(50 μL/张)、Ⅱ抗链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，Ⅲ抗辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液。最后滴加DAB-H2O2显色剂染色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，并经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，40×40倍显微镜下检测、图像获取数字分析系统保存图片于计算机供分析使用。

1.3.2 结果判读 由3位病理科医师组成诊断小组以双盲法形式分别对所有切片进行独立阅片，得出相应结果，当3位专家独立观察结果不一致时，经讨论最终判读切片病理性质特征。根据检测HPV16E7和Cyclin D1表达说明书提供资料，染色阳性对照用已知宫颈鳞状细胞癌病例切片1张，阴性对照是取各组切片1张，PBS取代Ⅰ抗，分别依照上述免疫组化相关步骤同时进行操作、染色和镜检，得出结果作为参考。HPV16E7或Cyclin D1阳性表达特征均为细胞核出现棕黄色或棕褐色细小和/或粗大颗粒。结合染色强度和阳性细胞数对结果进行判定[5]：光学显微镜下(40×40倍)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，按阳性细胞所占整个观察细胞百分比平均数划分，当阳性细胞数占整个观察细胞数百分比＜5%，视为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，＞50%为强阳性(+++)。+、++、+++统称阳性表达，－为阴性表达。

1.4 统计学方法 采用Origin 6.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用t检验；计数资料以率或百分比表示，两两比较采用χ2分割法；相关性分析用Pearson相关系数(r)法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达病理特征比较 HPV16E7和Cyclin D1在VCP组没有阳性表达或表达极少，整个细胞染成浅蓝色或蓝色；在LPL组有少量阳性表达，其病理特征为细胞核出现与背景染色不一样细而少黄色颗粒；在LSCC组，阳性表达非常强烈，更多细胞核出现黄色或黄褐色细网状或粗大颗粒，阳性细胞染色较深，呈灶状或弥漫分布，见图1。

图1 各组中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达病理特征比较（SP×400）

2.2 各组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率比较 与VCP组比较，LPL组HPV16E7阳性表达率稍有增加，但差异无统计学意义(χ2=0.48，P＞0.05)，Cyclin D1阳性表达率增加明显(χ2=4.97，P＜0.05)；LSCC组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率显著上升(χ2= 33.49、30.80，P均＜0.05)。与LPL组比较，LSCC组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率均显著增加(χ2= 27.91、16.74，P均＜0.05)，见表1。

表1 HPV16E7和Cyclin D1在各组中阳性表达率比较[例（%）]

2.3 LSCC组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达与临床分期和病理分级的关系 在临床分期中，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率在Ⅰ～Ⅳ期随分期增加呈上升趋势，即Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期；HPV16E7阳性表达率从Ⅰ期过渡到Ⅲ期时，差异无统计学意义(χ2= 4.45，P＞0.10)，但Ⅳ期与其他几期差异有统计学意义(χ2=10.79，P＜0.05)。Cyclin D1阳性表达率随着分期增加而显著增加，各期间差异有统计学意义(χ2=21.36，P＜0.05)，见表2。在病理分级中，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率随着病理组织分化程度减弱、分级增加呈现逐级增加趋势，即Ⅲ级＞Ⅱ级＞Ⅰ级，各级间差异均具有统计学意义(χ2=27.81、32.57，P＜0.005)，见表3。

2.4 LSCC与HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率之间相关性比较 在喉癌组织中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率与LSCC发生率均具有显著正相关(r=0.79、 0.86，P=0.003、0.002)；HPV16E7阳性表达率与Cyclin D1阳性表达也呈显著正相关(r=0.68，P=0.005)。

表2 喉癌中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率在临床分期中比较[例(%)]

表3 喉癌中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率在病理分级中比较[例(%)]

3 讨 论

LSCC是在大量不典型增生-癌变遗传病变积累基础上发生，其生物学行为是一种细胞周期紊乱性疾病，与原癌基因激活、抑癌基因失活、转录基因失调等异常生物学行为密切相关[6]。HPV16E7是致癌的重要转化基因，负责早期区编码HPV调整、转换及蛋白复制。有关它在LSCC组织中阳性表达的机制还不明确。随着对细胞调控认识，发现当患者遭受HPV感染后，负责控制细胞周期进程Cyclin D1将发生明显异常表达[7]，这在本实验中得到证实，LSCC组织中HPV16E7蛋白表达及其阳性率均明显高于LPL以及VCP组织，而伴随LSCC组织中HPV16E7阳性增加，Cyclin D1表达及其阳性率也显著高于LPL以及VCP组织。提示HPV可能是一种重要致癌病毒，且对喉组织具有趋嗜性，使得喉组织在HPV反复感染下积累到一定量后，造成LSCC发生。在此基础上，出现HPV16E7和处于细胞周期控制部位关键蛋白Cyclin D1表达水平显著增加[8]。本实验结果显示，在喉癌组织中，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率分别达到44.93%和52.17%，说明在喉癌发生过程中，HPV严重感染侵袭喉组织使得HPV16E7成为喉癌发生启动因素，Cyclin D1增加引起细胞周期紊乱，加速喉组织细胞异化，使得Cyclin D1成为加速和延续喉癌发生的维持因素。临床上通过检测喉组织中HPV16E7和Cyclin D1异常增加，能够从侧面反映出喉组织性质改变及恶化倾向[9]。另外，在LPL组织中，亦发现HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率也明显高于VCP组织，提示临床对于一些不典型增生和结构改变喉组织角化病、黏膜白班、疣状增生等需要引起高度重视，尽早开展药物治疗或择期手术，加强喉癌前病变防治与筛查，动态观察HPV16E7和Cyclin D1数值变化，把喉组织恶变趋势消除在萌芽状态[10]。

本实验结果证实，随着喉癌肿瘤临床分期增加，HPV16E7和Cyclin D1在Ⅰ～Ⅳ期之间阳性表达逐步增多。提示临床一旦检测到喉组织中HPV16E7和Cyclin D1蛋白阳性表达逐步增强，发生喉癌风险极高，喉癌细胞增殖调控明显增速、扩大和增多，喉癌细胞生成活跃程度增加，临床上应采取积极治疗措施，并为喉癌不同时段选择正确治疗方案[11]。另外，随着喉癌组织病理程度加重，细胞分化程度减弱，喉组织中HPV16E7和Cyclin D1蛋白阳性表达率都呈逐渐增加趋势，提示喉癌病理分型早于自身临床表现，当喉癌组织出现临床表现并检测出HPV16E7和Cyclin D1阳性表达时，喉癌病理特征显得更加严重，分化程度极低。说明喉组织中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达与喉癌临床分期和病理分级均具有显著相关性，检测喉组织中HPV16E7和Cyclin D1阳性表达，可用于喉癌恶性程度的评定，对喉癌患者早发现、早诊断和早治疗显得特别重要，两者可作为判断喉癌恶性程度和预后的一个重要参考指标[12]。

作为一种细胞周期紊乱性疾病，喉腔恶性肿瘤形成通路主要来自细胞周期网络调控系统中G1/S期循环途径，该调控系统在外来分裂刺激因素HPV强烈作用下，HPV16E7被激活并过度表达，直接或间接激活和增大处于G1中期Cyclin D1调控功能，最终造成喉癌肿瘤发生和发展[13]。所以，HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率与喉癌发生率均具有显著正相关，且HPV16E7阳性表达率与Cyclin D1阳性表达也呈现显著正相关。提示喉癌生成可能与患者遭受HPV感染，刺激喉组织中HPV16E7过度表达，并引起Cyclin D1活性增加有关。HPV16E7可能是促使喉癌形成的启动因素和初始条件，在其刺激因素作用下，诱发喉组织细胞周期中Cyclin D1过表达，并与细胞周期依赖性激酶结合，促使转录因子E2F与抑制蛋白分离而充分发挥转录因子作用，使喉组织中未成熟细胞在形成过程中跨过G1/S关卡，快捷由G1期向S期演进，致使未分化喉组织细胞无序增殖。并且Cyclin D1功能异常，阻断干扰素产生，增加外源DNA整合及突变，抵抗细胞凋亡，使细胞永生化，最终造成细胞增殖失控而促进喉癌发生[14]。总之，喉癌的发生和发展与HPV严重感染宿主细胞造成HPV16E7过度表达，并刺激Cyclin D1恶性增加密切相关。对喉组织中HPV16E7和Cyclin D1检测有利于提高临床对喉癌发病原因及其机制认识，对喉癌早期预防、诊断和治疗，以及患者预后评价均具有重要的临床意义。

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Effects and clinical significances of abnormal expressions of key proteins of laryngeal tissues on patients with laryngeal squamous cell carcinoma

ZENG Han-rong1,YANG Hong-nv1,LI Wen-xing2,TU Xing2,KONG Wei-jia2. 1.Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Zhijiang City,Zhijiang 443200,Hubei,CHINA;2.College of Life Science&Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects and clinical significances of abnormal expressions of human papillomavirus 16E7 protein(HPV16E7)and cell cycle protein D1(Cyclin D1)on patients with laryngeal squamous cell carcinoma.MethodsAll the pathologic specimens were collected from the patients with laryngeal diseases who underwent surgical treatment because of different causes in Department of Otolaryngology of our hospital from May 2012 to February 2015,which included laryngeal squamous cell carcinoma(LSC group)and vocal cord polyp(VCP group)as well as laryngeal precarcinoma lesions(LPL group),with 69 cases in each group.According to the correlated standard of 2010 InternationalAnti-CancerAssociation,the clinical stage and pathological degree were further developed in the specimens of LSC group.The expression levels and clinical pathological features of HPV16E7 and Cyclin D1 were detected through the immunohistochemical SP staining methods.Moreover,the positive expression rate and correlational difference were analyzed and compared by statistical software in the three groups.ResultsThe positive expressions of HPV16E7 and Cyclin D1 were observed in cell nucleus in LSC group,which got a great number of thick and brown particles.Compared with VCP and LPL groups,the positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 were significantly increased in LSC group(44.93%vs 2.90%and 5.80%,52.17%vs 8.70%and 23.19%,respectively),P＜0.01.Compared with VCP group,the positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 in LPV group were significantly increased(P＜0.05).The positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 were increasingly grown up from stageⅠto stageⅣ,and raised with degreeⅢ＞degreeⅡ＞degreeⅠin LSC group(P＜0.01,respectively).The positive expression rate of the two proteins had significant positive correlation with the incidence of LSC(r=0.79,0.86,P=0.003,0.002),and positive expression rate of HPV16E7 had also completed positive correlation with that of Cyclin D1 in LSC group(r=0.68,P=0.005).ConclusionThe occurrence and development of laryngeal carcinoma might have the significant relationship with HPV16E7 and Cyclin D1 in patients with LSC.To detect HPV16E7 and Cyclin D1 in laryngeal organization of patients might contribute to enhancement of early diagnosis and prognosis of survival of laryngeal carcinoma patients in clinic.

Laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC);Human papillomavirus 16E7 protein(HPV16E7); Cell cycle protein D1(Cyclin D1);Positive expression

R767

A

1003—6350（2017）05—0743—04

2016-09-07)

曾汉荣。E-mail：zenghr1963@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.019