高效液相色谱法测定饮料中的新红、诱惑红及赤藓红

李清伟，梁桂娟*，周祖亮

（贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550016）

高效液相色谱法测定饮料中的新红、诱惑红及赤藓红

李清伟，梁桂娟*，周祖亮

（贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550016）

利用高效液相色谱法测定饮料中的新红、诱惑红及赤藓红含量，确定了检测条件为：Agilent C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，柱温25℃，流动相为乙酸铵-甲醇(92∶8,V/V)，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长254 nm。结果表明，新红、诱惑红及赤藓红在0～50 μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.999 8)，平均加样回收率为91.0%～96.8%，平均相对标准偏差(RSD)为0.4%～2.9%，新红、诱惑红及赤藓红的检出限分别为0.10 mg/kg、1.00 mg/kg及0.70 mg/kg。该方法快速准确，适用于饮料中的新红、诱惑红及赤藓红含量的测定。关键词：新红；诱惑红；赤藓红；高效液相色谱法；饮料；检测

许多天然食品具有本身的色泽，这些色泽能促进人的食欲，增加消化液的分泌，因而有利于消化和吸收，是食品的重要感官指标。但是，天然食品色泽在加工保存过程中容易退色或变色，为了改善食品的色泽，人们常常在加工食品的过程中添加食用色素，以改善食品感官性质。在很长的一段时间里，由于人们没有认识到合成色素的危害，并且合成色素与天然色素相比较，具有色泽鲜艳、着色力强、性质稳定和价格便宜等优点，许多国家在食品加工行业普遍使用合成色素。随着社会的发展和人们生活水平的提高，越来越多的人对于在食品中使用合成色素会不会对人体健康造成危害提出了疑问。与此同时，大量的研究报告指出[1-4]，几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，某些合成色素会危害人体健康，诱发中毒甚至癌症，故不能多用或尽量不用。世界各国尤其是西方发达国家不仅在色素对人体健康影响方面做了大量调查和研究，而且在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定，多种合成色素已被禁止或严格限量使用。现在可以合法使用的食用合成色素品种已经大为减少[5]。在世界各国使用合成色素最多时，品种多达100余种，日本曾批准使用的合成色素有27种，现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种，现仅剩下7种[6-7]。目前在大多数国家和地区，合成色素没有被完全禁止使用，因此对合成色素的检测仍然是食品检测的一个重点[8-9]。目前报道的用于检测食品中新红、诱惑红及赤藓红的方法很多[10-12]，而对于色素样品的前处理一般费时费力，不适合大批量色素样品的处理。

本研究利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析检测饮料中的新红、诱惑红及赤藓红，利用固相萃取柱[13-15]优化色素样品前处理的方法，提高工作效率，以期为饮料中新红、诱惑红及赤藓红的检测和调查提供良好的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

饮料样品：市售；新红、诱惑红、赤藓红液体标准品（5 mL/支，1.00 mg/mL）：中国计量科学研究院。0.45 μm水相微孔滤膜：浙江力辰仪器科技有限公司。

甲醇（色谱纯）：德国Merck KGaA公司；乙酸铵（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ME1002TE/02型电子天平（感量0.01 g）、LE438型PH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD））：安捷伦科技有限公司；tufboVap LV自动氮吹仪：美国Biotage公司；Strata X-AW 33u固相萃取柱：美国Phenomenex公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件

Agilent C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温35℃，二极管阵列检测器，检测波长：254 nm，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution program

1.3.2 样品前处理

称取样品20.00 g（精确至0.01 g），加入50 mL水并混匀，再加入质量浓度为106 g/L亚铁氰化钾溶液5 mL和质量浓度为220g/L乙酸锌溶液5mL沉淀蛋白质，混匀后用冰乙酸调节pH值至5.0，最后用水定容至100mL，振荡摇匀，静置30 min，取20 mL上清液，以不超过1 mL/min的流速过固相萃取柱，再用10mL水洗去柱内残留杂质，待流干后用5 mL甲醇：氨水（95∶5，V/V）将柱内保留的色素洗脱至氮吹管，于50℃氮气吹干，残留物用水定容至1 mL，涡旋溶解，过0.45 μm水相微孔滤膜，滤液待上机分析。

1.3.3 标准溶液及标准曲线的制备

准确移取适量质量浓度为1 mg/mL新红、诱惑红及赤藓红标准储备液，用超纯水稀释成质量浓度分别为1μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的系列标准使用液。取标准品系列溶液分别进样10 μL，以峰面积（y）为纵坐标，新红、诱惑红及赤藓红含量（x）为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线线性回归方程。

1.3.4 色素含量计算

试样中新红、诱惑红及赤藓红含量的计算公式如下：

式中：X为试样中新红、诱惑红及赤藓红的含量，g/kg；c为样液中新红、诱惑红及赤藓红的含量，μg/mL；V为最后定容体积，mL；m为试样质量，g；d为样品稀释比。

2 结果与分析

2.1 标准品及样品溶液色谱图的绘制

根据1.3.1节的色谱操作条件，得到标准品中的新红、诱惑红及赤藓红高效液相色谱图见图1。由图1可知，所得新红出峰时间为5.599 min、诱惑红出峰时间为10.091 min及赤藓红出峰时间为14.338 min，色谱峰形对称，基线平稳，分离度好。

图1 混合标准品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard

2.2 标准曲线的绘制

以峰面积（y）为纵坐标，新红、诱惑红及赤藓红含量（x）为纵坐标，绘制新红、诱惑红及赤藓红的标准曲线见图2。由图2可知，新红、诱惑红及赤藓红标准曲线线性回归方程分别为y=20.742-0.809 3；y=18.042x-5.679 8；y=13.493x-4.3559，相关系数R2分别为1.000 0、0.999 6、0.999 6。结果表明，在0～50 μg/mL范围内二者线性关系良好。

图2 新红、诱惑红及赤藓红标准曲线Fig.2 Standard curves of new red,fancy red and erythrosine

将标准品使用溶液逐级稀释，以信噪比S/N=3时的浓度为能检测的最低浓度，根据本方法中样品的取样量和定容体积，测得新红的检出限为0.10 mg/kg、诱惑红的检出限为1.00 mg/kg、赤藓红的检出限为0.70 mg/kg。

2.3 回收率实验

精密称取样品20 g（精确至0.01 g），加入新红标液（1.00 mg/mL）20 μL，40 μL，80 μL（添加量分别为1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL），之后按1.3.2的前处理方法和1.3.1的色谱条件进行测定，每个水平平行测定3次，测定其回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。

表2 加标回收率实验结果Table 2 Results of adding standard recovery rate experiments

由表2可知，检测结果所得平均回收率为91.0%～96.8%，平均RSD为0.4%～2.9%，表示该方法准确度高。

2.4 精密度实验

对10μg/mL的新红标准品连续进样6次，每次进样10μL，根据峰面积计算结果RSD，结果见表3。

表3 精密度实验结果Table 3 Results of precision experiments

由表3可知，检测结果的平均RSD为0.91%，表明该检测方法精密度良好。

2.5 重现性实验

精确吸取来自同一批原料的试样，按上述测定方法平行测定6次，检验方法的重现性，结果见表4。

表4 重现性实验结果Table 4 Results of reproducibility experiments

由表4可知，检测结果的平均RSD为2.8%，表明该方法重现性好。

2.6 样品中新红、诱惑红及赤藓红含量的测定

抽检市面上不同来源的饮料共38份，按1.3.1和1.3.2的仪器条件和前处理方法进行上机测定，结果发现有5份样品含有新红、诱惑红或赤藓红，其余均为未检出，检出率为13.2%，测得值在0.008～0.014g/kg，均低于国家标准GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂国家标准》饮料中规定的限量值：新红0.05 g/kg；诱惑红0.1 g/kg；赤藓红0.05 g/kg。

3 结论

国标[16]中对色素样品的前处理方法采用聚酰胺吸附法及液-液分配法，该方法存在实验周期较长，实验效率较低，不适合大批量色素样品的处理。本研究建立了高效液相色谱法检测饮料中的新红、诱惑红及赤藓红含量的方法，结果表明，本方法前处理简单，准确度和精密度高，检出限低于国家标准，加标回收率91.0%～96.8%，相对标准偏差＜5%，符合食品检测的相关法规标准要求，能满足对样品快速准确地检测。

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Determination of new red,fancy red and erythrosine in drinks by HPLC

LI Qingwei,LIANG Guijuan*,ZHOU Zuliang
(Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Determination,Guiyang 550016,China)

The contents of new red,fancyred and erythrosine in drinks were determined by high performance liquid chromatography.The determination conditions were determined as chromatographic column Agilent C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)with ammonium acetate-water(92∶8,V/V)as mobile phase,column temperature 25℃,flowing rate 1.0 ml/min,injection volume 10 μL,detection wavelength 254 nm.The results showed that new red, fancy red and erythrosine showed good linear relationship in the range of 0-50 μg/ml(R2=0.999 8),the average recovery rate was 91.0%-96.8%,the relative standard deviation(RSD)was 0.4%-2.9%,and the detection limit of new red,fancy red and erythrosine was 0.10 mg/kg,1.00 mg/kg and 0.70 mg/kg.The method was quick and accurate for detection of the new red,fancy red and erythrosine contents in drinks.

new red;fancy red;erythrosine;HPLC;drinks;determination

O657.72

0254-5071（2017）03-0175-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.035

2016-11-25

李清伟（1980-），男，工程师，本科，研究方向为食品分析与检测。

*通讯作者：梁桂娟（1972-），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品分析与检测。