何首乌乙酸乙酯提取物对秀丽线虫的抗衰老作用研究Δ

唐进法，张帆，李宇辉，吴宿慧，李寒冰，李伟霞，李学林#（.河南中医药大学第一附属医院药学部，郑州 450000；.河南中医药大学药学院，郑州 450000）

何首乌乙酸乙酯提取物对秀丽线虫的抗衰老作用研究Δ

唐进法1＊，张帆2，李宇辉2，吴宿慧2，李寒冰2，李伟霞1，李学林1#（1.河南中医药大学第一附属医院药学部，郑州 450000；2.河南中医药大学药学院，郑州 450000）

目的：研究何首乌乙酸乙酯提取物（EPM）对秀丽线虫（简称“线虫”）寿命的影响，考察EPM抗衰老作用。方法：设立EPM低、中、高浓度组（25、37.5、50 mg/L，以生药计）和空白组（0 mg/L），考察EPM对线虫寿命的影响；设立EPM组（37.5 mg/L）和空白组（0 mg/L），分别进行线虫的生殖实验、急性热应激实验和急性氧化应激实验，考察EPM对线虫生殖能力以及压力应激的影响。结果：在寿命实验中，EPM低、中、高浓度组线虫的平均寿命较空白组均显著延长（P＜0.05或P＜0.01），以中浓度EPM作用最为明显；增殖实验中，EPM组线虫在第2、3天中的子代数量较空白组显著增加（P＜0.05）；在急性热应激实验和急性氧化应激实验中，EPM组线虫的平均生存时间较空白组明显延长（P＜0.05）。结论：37.5 mg/L的EPM能延缓线虫衰老且不损害其生殖能力。

何首乌；乙酸乙酯提取物；抗衰老；秀丽线虫；寿命；氧化应激；热应激

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorumThunb.）的干燥块根，味苦、甘、涩，性微温，炮制后具有补肝肾、益精血、乌须发等作用。《本草纲目》载：“何首乌……久用长筋骨、益精髓、延年不老……”[1]。现代药学研究表明，制首乌主要含有二苯乙烯苷类、磷脂等成分，具有抗衰老、调节血脂等功效，是我国传统的抗衰老中药[2-3]。目前，何首乌抗衰老的作用及其机制研究多以小鼠、果蝇、鹤鹑等[4-5]作为动物模型，但因培养条件高、寿命周期长、研究成本高、近亲繁殖等因素限制了对其更深入的研究。

有研究表明，daf-2突变体的寿命是正常寿命的2倍，这标志着秀丽线虫正式进入衰老研究领域[6]。因其具有易饲养、自我繁殖力强、与人类的同源性基因数量多等优点，使其逐渐成为国际上公认的研究抗衰老的模式生物，有望替代小鼠等动物模型成为中药抗衰老研究的首选模型[7-10]。本研究以野生秀丽线虫（株系N2）的存活时间、生殖能力和急性热、氧化应激能力等作为指标，研究何首乌乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extract fromP.multiflora，EPM）的抗衰老作用，为进一步研究其抗衰老机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

SMZ-140台式显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）。

1.2 药材与试剂

何首乌采自广州石鼓镇，经河南中医药大学第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定为正品；氯仿、乙酸乙酯和二甲基亚砜等试剂均为分析纯。

1.3 菌株与线虫

大肠埃希菌（OP50）和野生秀丽线虫（N2）均由北京生命科学院董梦秋实验室惠赠。

2 方法

2.1 药材的处理

2.1.1 药材的炮制 取适量何首乌，用80%黑豆汁拌匀闷润约8 h，高压清蒸6 h，然后将样品置于采光好的地方，放置1天1夜使其干透，此为一蒸一晒。反复9次蒸、晒即得[11]。

2.1.2 药液的制备 取283 g上述何首乌炮制品，加10倍量水提取，将水提液浓缩至168 mL后，取84 mL浓缩液，依次用等体积氯仿萃取5次，收集萃取液。取上层萃取液，用等体积乙酸乙酯萃取9次，收集萃取液并置于水浴锅中挥干溶剂，即得EPM。取适量EPM，由二甲基亚砜（浓度＜1%）助溶于超纯水中，制备成质量浓度分别为25、37.5、50 mg/L的EPM药液。

2.2 线虫的培养

将线虫接种于涂布有大肠埃希菌的NGM（Nematode growth media）培养基上，将培养基置于20℃生化培养箱中培养，观察线虫的生长情况并定期更换培养基[12]。挑选表面光滑、无气泡、无划痕的培养基进行接种。

2.3 线虫的寿命实验

实验设置EPM低、中、高浓度组（25、37.5、50 mg/L，以生药计）和空白组（0 mg/L）。参考文献[13]中方法，每个组分别挑取2～3条生殖期线虫进行实验，当线虫产卵1 h后均放入20℃生化培养箱中；待发育至第四阶段幼虫期（即L4期）后，转入含相应药物的培养皿中。每组线虫数量均为20条，此时记为寿命实验第0天。每天观察并记录线虫生存、死亡及剔除的数量（在寿命实验期间，发现线虫对外界刺激没有应答时视为死亡；剔除逃离培养基表面而干死、虫卵在体内孵化而成袋样虫或者钻进培养基内部的线虫[14]）。

2.4 线虫的生殖实验

每组分别挑选10条L4期线虫（同寿命实验），单独每条转至标记的空白组（0 mg/L）和EPM组（37.5 mg/L）中，此时记为生殖实验第1天。以后每24 h移至相应的培养基中直至线虫生殖能力丧失。将线虫转移前的培养基置于20℃培养箱中培养24 h后计算子代数量（即产卵数量）[15]。

2.5 线虫的急性热应激实验

[16]中方法，将线虫分别置于空白组（0 mg/L）和EPM组（37.5 mg/L）的培养基中产卵0.5 h；将受精卵在20℃条件下孵育58 h后，在35℃条件下进行热应激实验。每隔1 h记录1次每组线虫死亡以及存活的数量（线虫死亡的判定标准同寿命实验）。

2.6 线虫的急性氧化应激实验

参考文献[17]方法，将线虫置于空白组（0 mg/L）或EPM组（37.5 mg/L）的培养基中产卵0.5 h；将受精卵在20℃下孵育58 h后，将线虫分别置于标记好的含有0.4 mmol/L双氧水（H2O2）的96孔板中，每个孔内放置5条线虫，每0.5 h记录1次线虫死亡以及存活的数量（线虫死亡的判定标准同寿命实验）。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。实验数据以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 寿命实验结果

不同质量浓度的EPM均能使线虫的生命曲线右移（详见图1），均能延长线虫的寿命。空白组和EPM低、中、高浓度组线虫的平均寿命分别为（17.50±6.88）、（22.40±8.16）、（23.50±7.42）、（22.97±7.86）d。这提示EPM低、中、高浓度组线虫的平均寿命与空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且以EPM质量浓度为37.5 mg/L时延长寿命效果最好。因此用该质量浓度作为其他生理指标的实验浓度。

图1 不同质量浓度EPM作用后秀丽线虫的生命曲线Fig 1 Life curves of caenorhabditis elegans after different concentrations of EPM

3.2 生殖实验结果

EPM组和空白组线虫均为培养第2天的子代数量最多，之后呈下降趋势。其中培养第2、3天后EPM组的子代数量均显著多于空白组（P＜0.05）；在总子代数量上，EPM组多于空白组，但差异无统计学意义（P＞0.05），结果详见表1。

3.3 急性热应激实验结果

EPM能显著增强线虫的耐热能力，延长线虫在35℃条件下的平均存活时间。与空白组线虫的平均存活时间[（16.23±1.65）d]比较，EPM组线虫的平均存活时间（[17.83±1.45）d]显著延长（P＜0.05）。

3.4 急性氧化应激实验结果

EPM能显著提高线虫的抗氧化能力，延长线虫在0.4 mmol/L H2O2中的平均存活时间。与空白组线虫的平均存活时间[（5.810±1.800）d]比较，EPM组线虫的平均存活时间[（7.287±2.030）d]显著延长（P＜0.05）。

表1 各组线虫子代数量测定结果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

表1 各组线虫子代数量测定结果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

注：与空白组比较，＊P＜0.05Note：vs.blank group，＊P＜0.05

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4 讨论

线虫同期化即将所需的线虫控制在同一发育期，这将有利于对其表征进行对比实验，故在测定各项指标前需要对线虫进行同期化处理。当所需同期化线虫少时，可采用限时产卵法进行处理[13]；反之，可采用高氯酸钠漂白法[9]进行处理。饮食限制即对线虫进行热量限制，是延长线虫寿命的一种方法。因此，在进行寿命实验前应考虑EPM是否具有抑制大肠埃希菌的作用，设定药液的质量浓度应低于药物对大肠埃希菌最小抑制浓度（MIC）[18]。笔者在前期抑菌试验中发现，EPM对大肠埃希菌的MIC为60 mg/L，且自该质量浓度起对线虫开始出现毒害作用，个别线虫的受精卵聚于阴户，形成异形虫。因此，在本研究寿命实验中设置EPM质量浓度分别为25、37.5、50 mg/L。

常见的线虫给药方式有以下两种：（1）在配制NGM培养基时添加所需质量浓度的药液，再经过灭菌分装即可[19]；（2）先配制好所需不同质量浓度的药液，然后将各质量浓度药液直接滴加至涂布有大肠埃希菌的NGM培养基中[14]。然而值得考虑的是，在第一种方法中药物有效成分的含量以及药效是否会受到灭菌操作的影响；第二种方法中线虫是否有可能进食不含药液的大肠埃希菌。综合以上考虑，在本研究中笔者先将一定量大肠埃希菌和不同质量浓度的药液混合均匀后，再一起滴加至NGM培养基中，然后将培养基置于生化培养箱中培养若干小时后进行实验。

部分科学家认为长寿和生殖力之间存在“利弊权衡”，即寿命延长和生殖能力成反比。延长寿命和生殖需要资源，而体内的资源是有限的，延长线虫寿命这部分资源应该是来源于降低繁殖后代能力的资源[20]。但随着进一步研究发现，两者并不总是成反比，如蔡外娇等[21]研究发现，淫羊藿总黄酮不仅能延长线虫寿命，而且能提高其生殖能力；何首乌中所含的白藜芦醇在延长线虫寿命的同时不影响其生殖能力[19]。可见，本研究考察线虫的生殖指标是有意义的。在抗衰老研究中，压力应激实验也是较为重要的[22]。研究显示，寿命的延长有可能是因为应激能力的提升，而且已知线虫的长寿突变体在热休克、氧化以及紫外辐射等压力下，存活率均高于同等条件下的野生型线虫[6]。

本研究仅采用野生型秀丽线虫N2进行寿命、生殖等生理指标的测定，下一步可再采用某些基因型的突变体进一步验证所得结论。秀丽线虫自身对外界环境影响较为敏感，在实验过程应尽量排除干扰因素，增大样本，减少误差。实验过程中添加的二甲基亚砜是非质子极性溶剂，也是一种透皮吸收剂，可促进药物的渗透。关于寿命实验的分组，本研究只设置了空白组和EPM组，还可以考虑添加二甲基亚砜组。目前，线虫实验的给药方式常用的有两种，可设立这两种不同加药方式的分组，分别与空白组进行比较，从而得出最佳的给药方式。

本研究结果显示，EPM组（37.5 mg/L）线虫在各项指标上与空白组比较均有显著差异，这证明了EPM能延长线虫平均寿命、提升线虫生殖能力、延长线虫在压力应激环境下的平均存活时间，具有延缓衰老的功效。本课题组后续将重点开展EPM抗衰老的机制研究。

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Anti-aging Effect Study of Ethyl Acetate Extract from Folygonum multiflora on Caenorhabditis Elegans

TANG Jinfa1，ZHANG Fan2，LI Yuhui2，WU Suhui2，LI Hanbing2，LI Weixia1，LI Xuelin1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To study the lifespan effect of ethyl acetate extract fromPolygonum multiflora（EPM）on caenorhabditis elegans，and to investigate its anti-aging effect.METHODS：EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（25，37.5，50 mg/L，calculated by crude drug）and blank group（0 mg/L）were established to investigate the effects of EPM on the lifespan of caenorhabditis elegans.EPM group（37.5 mg/L）and blank group（0 mg/L）were established to perform reproductive test，acute heat stress test and acute oxidative stress test of caenorhabditis elegans.The effects of EPM on reproductive capacity and pressure stress of caenorhabditis elegans were investigated.RESULTS：The lifespan test，average lifespan of cae-norhabditis elegans in EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were prolonged significantly，compared to blank group（P＜0.05 or P＜0.01），especially in EPM medium-concentration group.In reproductive test，the number of offspring of caenorhabditis elegans in EPM group on the second and third day were increased significantly，compared to blank group（P＜0.05）.In acute heat stress test and acute oxidative stress test，average survival time of caenorhabditis elegans in EPM group was prolonged significantly（P＜0.05）.CONCLUSIONS：37.5 mg/L EPM can retard the aging process of caenorhabditis elegans and doesn't damage the reproductive capacity.

Polygonum multiflora；Ethyl acetate extract；Anti-aging；Caenorhabditis elegans；Lifespan；Oxidative stress；Heat stress

R285

A

1001-0408（2017）04-0493-04

2016-03-28

2016-06-20）

（编辑：林静）

2015年度河南省中医药科学研究专项课题（No.2015ZY02101）

＊副主任药师，硕士生导师。研究方向：中药药动学。电话：0371-66233562。E-mail：a0519@163.com

#通信作者：主任药师，博士生导师。研究方向：中药的合理应用及中药的应用形式。电话：0371-66245342。E-mail：lixuelin450000@ 163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.17