丁苯酞对Aβ1-42诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究Δ

黄江，姜鲜，宋大强，刘明华，章卓#（.西南医科大学药学院药理教研室，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医院药剂科，四川 泸州 646000；.西南医科大学附属医院麻醉科，四川 泸州 646000）

丁苯酞对Aβ1-42诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究Δ

黄江1，2＊，姜鲜3，宋大强1，刘明华1，章卓1#（1.西南医科大学药学院药理教研室，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医院药剂科，四川 泸州 646000；3.西南医科大学附属医院麻醉科，四川 泸州 646000）

目的：研究丁苯酞对β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的保护作用及其机制。方法：将HUVEC分为正常对照组、Aβ1-42组、TAK242组（10 nmol/L）、二甲基亚砜（DMSO）组（1‰DMSO）和丁苯酞低、中、高浓度组（40、80、160 μg/L），除正常对照组和DMSO组外，其余各组细胞均加入50µmol/LAβ1-42培养HUVEC 24 h，同时TAK242组、DMSO组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞还加入相应浓度的药物作用30 min，每个浓度3个复孔。CCK-8法测定细胞活力，Hochest 33342/PI双染法观察细胞凋亡情况，膜联蛋白（Annexin）Ⅴ-异硫氰酸荧光素（FITC）流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot法检测细胞中果蝇样受体4（TLR4）、环氧合酶2（COX-2）蛋白表达，ELISA法检测细胞中白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。结果：与正常对照组比较，Aβ1-42组细胞活力减少、凋亡率增加，TLR4、COX-2蛋白表达和IL-1、TNF-α含量增加；与Aβ1-42组比较，TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞活力增加、凋亡率减少，TLR4、COX-2蛋白表达和IL-1、TNF-α含量减少，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论：丁苯酞可改善Aβ1-42所致的HUVEC凋亡，其机制可能与抑制TLR4、COX-2和炎症因子表达有关。

β-淀粉样蛋白1-42；人脐静脉内皮细胞；细胞凋亡；机制

β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的沉积导致脑血管内皮损伤可能是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）发病机制之一，可能与Aβ致血管内皮细胞细胞凋亡，产生炎症反应以及内皮功能障碍等有关[1]。人体内最常见的亚型是Aβ1-40和Aβ1-42。果蝇样受体4（Toll-like receptor-4，TLR4）是机体参与炎症信号的重要受体之一，特异性配体可以激活TLR4信号通路，激活环氧合酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2），释放炎症因子白细胞介素1（Interleukin 1，IL-1）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）[2]。Aβ诱导血管内皮细胞凋亡也可能与TNF-α、IL-1的释放及COX-2等基因改变有关[3]。丁苯酞（Butylphthalide）具有神经功能保护作用，能抑制TLR4表达及炎症介质释放[4]。据此笔者通过体外培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）研究丁苯酞是否能减轻Aβ1-42诱导的HUVEC凋亡，探讨其保护效应与TLR4/COX-2表达的关系，为了解丁苯酞保护Aβ所致血管内皮损伤的机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

PAC300型垂直型电泳槽和湿式电转膜槽转膜仪（美国Bio-Rad公司）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CKX41型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；SpectraMaxM3型酶标仪（美国MDS公司）；TCS SP5型激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司）；SBK-YLQX-003552型流式细胞仪（美国BD公司）；MR23i型超低温离心机（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 药品与试剂

丁苯酞软胶囊（石药集团恩必普药业有限公司，批号：20151011，规格：每粒100 mg）；兔TLR4多克隆抗体、兔COX-2多克隆抗体（美国Abcam公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Aβ1-42多肽（北京奥普森有限公司）；TLR4阻滞剂TAK242（美国MCE公司，批号：20151112，纯度：98.10%）；IL-1、TNF-α试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司）；Hochest 33342、碘化丙啶（PI）、膜联蛋白（Annexin）Ⅴ-异硫氰酸荧光素（FITC）（碧云天生物技术有限公司）。

1.3 细胞

HUVEC购自上海拜力生物试剂有限公司。

2 方法

2.1 CCK-8法检测HUVEC细胞活力

Aβ1-42在37℃下孵育1周使其变为聚集状态备用。HUVEC常规培养。将HUVEC分为正常对照组、Aβ1-42组、TAK242组（10 nmol/L）、二甲基亚砜（DMSO）组（1‰DMSO）和丁苯酞低、中、高浓度组（40、80、160 μg/L）。除正常对照组和DMSO组外，其余各组细胞均加入50 µmol/L Aβ1-42培养24 h，同时TAK242组、DMSO组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞还加入相应浓度的药物作用30 min，每个浓度3个复孔。24 h后每孔细胞加入CCK-8 10 μL继续培养1 h。酶标仪450 nm波长处测定光密度（OD），以OD值的大小评价细胞活力。TAK242用 DMSO溶解，DMSO终浓度小于1‰。

2.2 Hochest 33342/PI双染法观察HUVEC凋亡情况

将HUVEC分为正常对照组、Aβ1-42组、TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组（40、80、160 μg/L），同“2.1”项下方法加药培养24 h后，Hochest 33342/PI双染检测HUVEC凋亡情况。具体方法：收集培养24 h后的细胞悬浮于1 mL培养基中，加入10 μL Hochest 33342贮存液（100 mg/L，蒸馏水溶解），染色15 min；冰上冷却，3 000× g离心5 min，去上清，细胞重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，加5 μL PI液（1 g/L，蒸馏水溶解），混匀；显微镜下观察细胞核，蓝色为正常细胞，亮蓝色为凋亡细胞，红色为死亡细胞。

2.3 AnnexinⅤ-FITC流式细胞仪检测HUVEC凋亡率

同“2.2”项下分组加药培养HUVEC 24 h，消化收集细胞，冷PBS洗2次，悬浮于AnnexinⅤ混合缓冲液（1× 106mL－1）中。取100 μL细胞悬液加5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，轻摇细胞，室温下暗处放置15 min，1 h内流式细胞仪分析细胞凋亡率。

2.4 Western blot法检测HUVEC中TLR4、COX-2蛋白表达

采用Western blot法检测HUVEC中TLR4、COX-2蛋白表达。同“2.2”项下分组加药培养HUVEC 24 h，冰上裂解10 min，4℃下12 000×g离心10 min，取上清备用。采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，采用8%分离胶和4%的浓缩胶，加蛋白样后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，电转120 min，与兔TLR4多克隆抗体、兔COX-2多克隆抗体4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，加入HRP标记山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育，洗膜，显影。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，用图像分析仪扫描，Image Pro-plus软件测定蛋白条带OD，以相应蛋白与内参OD值的比值评价蛋白表达。

2.5 ELISA法检测HUVEC中IL-1、TNF-α含量

同“2.2”项下分组加药培养HUVEC 24 h，收集细胞上清，4℃下1 500×g离心10 min，按ELISA法，以IL-1、TNF-α试剂盒说明书操作，酶标仪于450 nm波长处测定IL-1、TNF-α含量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 细胞活力

正常对照组、Aβ1-42组、TAK242组、DMSO组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞的OD值分别为0.99±0.12、0.79±0.07、0.94±0.11、1.02±0.09、0.92±0.04、0.97± 0.03、0.99±0.07。与正常对照组比较，Aβ1-42组细胞OD值明显降低；与Aβ1-42组比较，TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞的OD值均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组与DMSO组比较细胞的OD值无明显变化（P＞0.05）。

3.2 细胞凋亡情况

Hochest 33342/PI双染显示，正常对照组细胞形态呈圆形，细胞核呈淡蓝色，几乎无凋亡细胞；Aβ1-42组多数细胞细胞核呈亮蓝色，凋亡细胞较多，还可见红色细胞核的死亡细胞；丁苯酞高浓度组凋亡细胞较少，丁苯酞中、低浓度组和TAK242组可见少量凋亡细胞。各组细胞凋亡染色图见图1。

图1 各组细胞凋亡染色图（Hochest 33342/PI，×200）Fig 1 Cell apoptosis staining in each group（Hochest 33342/PI，×200）

3.3 细胞凋亡率

正常对照组、Aβ1-42组、TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞的凋亡率分别为0.89%、21.89%、1.81%、11.12%、5.32%、2.31%。与正常对照组比较，Aβ1-42组细胞的凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与Aβ1-42组比较，TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞的凋亡率均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3.4 细胞中TLR4、COX-2蛋白表达

与正常对照组比较，Aβ1-42组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Aβ1-42组比较，TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达均明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。各组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达的电泳图见图2，测定结果见表1。

3.5 细胞中IL-1、TNF-α含量

与正常对照组比较，Aβ1-42组细胞中IL-1、TNF-α含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Aβ1-42组比较，TAK242组和丁苯酞低、中、高浓度组细胞中IL-1、TNF-α含量均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。各组细胞中IL-1、TNF-α含量的测定结果见表2。

4 讨论

图2 各组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达的电泳图Fig 2 Electrophoresis of protein expression of TLR4 and COX-2 in HUVECs of each group

表1 各组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达的测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expression of TLR4 and COX-2 in HUVECs of each group（±s，n＝3）

表1 各组细胞中TLR4、COX-2蛋白表达的测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expression of TLR4 and COX-2 in HUVECs of each group（±s，n＝3）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与Aβ1-42组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.Aβ1-42group，#P＜0.05，##P＜0.01

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表2 各组细胞中IL-1、TNF-α含量的测定结果（±s，n＝3，pg/mL）Tab 2 Determination results of the contents of IL-1 and TNF-α in HUVECs of each group（±s，n＝3，pg/mL）

表2 各组细胞中IL-1、TNF-α含量的测定结果（±s，n＝3，pg/mL）Tab 2 Determination results of the contents of IL-1 and TNF-α in HUVECs of each group（±s，n＝3，pg/mL）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与Aβ1-42组比较，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.Aβ1-42group，##P＜0.01

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尽管血管因素在AD的发生和进展中的作用越来越引起人们的重视，但Aβ致血管内皮损伤机制目前并未完全清楚。AD血管的异常包括不规则血管形成、微血管密度降低、小动脉和毛细血管萎缩、血管内皮功能退化、脑血管结构改变等[3]。Toll样受体是机体最重要的模式识别受体之一，其通过启动不同的信号途径参与了机体的天然与获得性免疫调节，目前发现约有12种Toll样受体[5]。其中TLR4是识别特异性配体LPS的主要受体，是机体参与炎症信号的重要受体之一，TLR4激活后，会启动Myd88依赖和非Myd88依赖的信号通路，激活下游COX-2释放，激发炎症因子，从而参与炎症反应[6]。TLR4可能参与了AD的血管内皮细胞凋亡[7]。有资料显示，LPS启动的TLR4通路参与了AD的发生，比如利用LPS腹腔注射和脑内注射，均发现大鼠海马tau蛋白不同位点出现了过度磷酸化的改变[8]。如果敲除掉与LPS连接的CD14，则可减少由Aβ诱导的小胶质细胞的激活[9]。另有研究也发现，Aβ能够刺激TLR4野生型小鼠大脑分泌更多的炎症因子，如TNF-α、IL-1、IL-10和IL-17。同TLR4野生型小鼠比较，TLR4缺乏或者突变的小鼠更容易发生淀粉样沉积和弥散[10]。由此可知，TLR4可能与AD发生过程中内皮细胞损伤存在一定联系。

丁苯酞在临床上可用于AD的防治[11]，对Aβ1-42诱导的HUVEC凋亡可能具有保护效应。HUVEC的优点在于较为稳定、易于实验操作，故本研究选择了HUVEC作为研究对象。结果显示，Aβ1-42刺激HUVEC后，细胞凋亡明显增加，细胞活力下降；与Aβ1-42组比较，丁苯酞作用后减少了Aβ1-42诱导的血管内皮细胞凋亡率，提高了细胞活力，因此其具有一定的保护效应。

进一步研究丁苯酞保护效应是否与抑制TLR4表达和炎症因子释放有关。研究结果显示，与Aβ1-42刺激后的HUVEC比较，给予TLR4阻滞剂的细胞凋亡明显减少，细胞活力提高，提示TLR4的激活可能参与了Aβ1-42刺激后的HUVEC细胞凋亡。同时，给予TLR4阻滞剂后，炎症因子IL-1和TNF-α明显减少，COX-2表达减少，提示Aβ1-42刺激后的HUVEC细胞凋亡与炎症因子IL-1、TNF-α、COX-2表达减少有关。丁苯酞作用后减少了Aβ1-42诱导的HUVEC中TLR4、COX-2蛋白表达，也明显减少了炎症因子IL-1、TNF-α表达，推测其保护效应与抑制TLR4表达和炎症因子表达有关。

综上所述，TLR4参与了Aβ1-42刺激后的HUVEC细胞凋亡；丁苯酞对Aβ1-42诱导的HUVEC细胞凋亡具有明显的保护效应，其保护效应可能与抑制TLR4启动的信号通路中COX-2与炎症因子表达有关。其他的Toll受体亚型是否也参与了丁苯酞的保护作用值得进一步研究。

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Protective Effect of Butylphthalide on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Apoptosis Induced by Aβ1-42and Its Mechanism

HUANG Jiang1，2，JIANG Xian3，SONG Daqiang1，LIU Minghua1，ZHANG Zhuo1（1.Pharmacology Teaching and Research Section，School of Pharmacy，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China；2.Dept. of Pharmacy，the Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China；3.Dept.of Anesthesiology，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To study the protective effect of butylphthalide on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）induced by Aβ1-42and its mechanism.METHODS：HUVECs were divided into normal control group，Aβ1-42group，TAK242 group（10 nmol/L），DMSO group（1‰DMSO）and butylphthalide low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（40，80，160 μg/L）.Except for normal control group and DMSO group，other groups were given 50 µmol/L Aβ1-42to culture HUVECs for 24 h.TAK242 group，DMSO group and butylphthalide low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were given relevant concentration of drugs for 30 min，with 3 holes for each concentration.The cell viability was determined by CCK-8 assay；cell apoptosis was observed by Hochest 33342/PI double staining；the cell apoptotic rate was detected by AnnexinⅤ-fluorescein isothiocyanate（FITC）flow cytometry；the protein expression of TLR-4 and COX-2 were determined by Western blot assay；the contents of IL-1 and TNF-α were detected by ELISA.RESULTS：Compared with normal control group，cell viability of HUVECs were decreased in Aβ1-42group；while apoptotic rate，protein expression of TLR4 and COX-2，the contents of IL-1 and TNF-α were increased.Compared with Aβ1-42group，cell viability of HUVECs were increased in TAK242 group and butylphthalide low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups；while apoptotic rate，protein expression of TLR4 and COX-2，the contents of IL-1 and TNF-α were decreased，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Butylphthalide can reduce HUVECs apoptosis induced by Aβ1-42，which may be related with inhibiting the expression of TLR4，COX-2 and inflammatory factors.

Aβ1-42；Human umbilical vein endothelial cells；Cell apoptosis；Mechanism

R361+.3；R967

A

1001-0408（2017）04-0483-04

2016-09-16

2016-10-27）

（编辑：邹丽娟）

四川省科技厅一般项目（No.2014S20071）；泸州市科技局科技支撑计划项目（No.2013LZLY-J52）

＊主管药师，硕士研究生。研究方向：分子药理学。电话：0830-3162291。E-mail：354699170@qq.com

#通信作者：副教授，硕士。研究方向：分子药理学。电话：0830-3162291。E-mail：zhhuozhang100@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.14