肾透明细胞癌患者血清miR-214的表达及临床意义

何江伟，哈木拉提·吐送，王玉杰，王文光

肾透明细胞癌患者血清miR-214的表达及临床意义

何江伟，哈木拉提·吐送，王玉杰，王文光

目的 探讨血清miR-214在肾透明细胞癌患者中的表达及在诊断、治疗及预后判断方面的临床意义。方法 选择我院确诊的肾透明细胞癌30例(肾癌组)，选取同期在我院体检健康的30例(对照组)。对照组随机检测血清miR-214水平，肾癌组于术前、术后1周及术后1个月检测血清miR-214变化，比较组间的表达差异及其与临床参数的关系。结果 肾癌组术前、术后1周与对照组血清miRNA-214相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)；肾癌组术前与术后1个月、术后1周与术后1个月之间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；肾癌组术前与术后1周、术后1个月与对照组之间比较差异无统计学意义(P=0.318，P=0.383)。利用受试者工作特征曲线做鉴别检验，获得曲线下面积(AUC)=0.858[95%CI(0.756,0.960)，P<0.05]，根据Youden指数找出最佳诊断点为2.91，敏感度为80.0%，特异度为90.0%。结论 血清miR-214与肾透明细胞癌有明显相关性，可作为该病的潜在生物标记物。

微小RNAs；肾透明细胞癌；肿瘤标记，生物学

2012年全球新发癌症病例超过1410万，死亡人数超过820万，其中男性肾癌患者超过20万[1]，死亡率大于50%[2]。肾细胞癌是常见的肾脏恶性肿瘤，来源于肾小管上皮，其中肾透明细胞癌约占肾细胞癌的75%～80%，是肾细胞癌最常见的亚型。由于肾肿瘤早期常无任何临床症状,故早期诊断较困难。影像学检查等方法在早期诊断方面灵敏度不高，限制了其在早期诊断中的应用。随着人们对健康的需求及生活水平的提高，临床迫切需要一种用于早期诊断、治疗和判断预后的方法。大量研究证明miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关,可作为一种潜在的生物标志物。Mitchell等[3]研究报道，血清特异性miRNAs来源于肿瘤组织，与其表达水平一致。多项研究发现miR-214参与了肿瘤细胞的分化、生存和凋亡[4-6]。本文探讨miR-214在肾透明细胞癌患者手术前后及健康志愿者血清中的表达差异，旨在发现其与肾透明细胞癌的关系，为进一步的研究及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选择我院2013年7月—2016年4月确诊的肾透明细胞癌30例(肾癌组)，其中男、女各15例；年龄(53±12)岁，分别于术前、术后1周及术后1个月采集血液样本。选择同期在我院体检健康的30例(对照组)，其中男14例，女16例；年龄(54±10)岁，随机采集血液样本。两组均清晨空腹采集静脉血3～5 ml,放置2 h,待血液充分凝固后，在温度4℃、转速3000 r/min的情况下离心10 min，收集上清液，保存于-80℃冰箱中备用。本研究经过我院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂及仪器 β-巯基乙醇、无水乙醇等常规试剂、分光光度计Nanodrop ND-1000(Thermo)、普通多聚酶链式反应(PCR)仪、Real-time PCR仪(ABI 7500)、离心机、-80℃超低温冰箱、制冰机等均由我院实验室提供。mirVanaTMPARISTM试剂盒(Ambion)、revertAid First strand cDNA synthesis kit(Thermo)、Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)(Thermo)、相关引物(由life公司合成)等均由我院提供。

1.3 方法 严格按照mirVanaTMPARISTMKit说明书提取血清中总RNA，完成后用分光光度计Nanodrop ND-1000检测，若A260/A280在1.9～2.1之间，则符合要求。根据revertAid First strand cDNA synthesis kit说明书进行反转录聚合酶链反应。根据Maxima SYBR Green qPCR Master Mis说明书进行实时荧光定量PCR。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。对表示倍数关系的数据进行正态方差分析和方差齐性检验，对不服从正态分布的数据，多样本比较采用非参数 Kruskkal-Wallis H秩和检验，组间比较采用 Wilcoxon 秩和检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

肾癌组术前、术后1周及术后1个月血清miR-214相对表达量中位数(四分位间距)分别为6.321(4.867,7.911)、4.959(2.884,9.567)、1.214(0.685,3.171)，对照组血清miR-214相对表达量为1.045(0.444,1.451)。

肾癌组术前、术后1周与对照组血清miR-214相对表达量比较差异均有统计学意义(P<0.05)；肾癌组术前与术后1个月、术后1周与术后1个月之间差异有统计学意义(P<0.05)；肾癌组术前与术后1周、术后1个月与对照组之间差异无统计学意义(P=0.318，P=0.383)，见图1。

图1 肾透明细胞癌组与健康对照组血清miR-214相对表达量的比较

按照性别、平均年龄、肿瘤直径及Fruhman分级[7]对肾癌组血清miR-214表达量进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。根据肾癌组血清miR-214表达量的差异，利用受试者工作特征(ROC)曲线做鉴别检验，获得曲线下面积(AUC)=0.858[95%CI(0.756,0.960)，P<0.05]，根据Youden指数得出最佳诊断点为2.91，敏感度为80.0%，特异度为90.0%，见图2。

表1 肾透明细胞癌患者一般资料与血清miR-214表达水平的关系

图2 肾透明细胞癌患者的受试者工作特征曲线

3 讨论

肾透明细胞癌多为局限性癌，临床对于局限性肾细胞癌首选外科手术治疗，5年生存率可达80%～90%，若出现肿瘤转移或复发，5年生存率则低于10%[4]。目前肾透明细胞癌对放化疗缺乏敏感性，在肿瘤发生转移或复发后，医生常感到非常棘手。近年来靶向药物治疗给发生转移及复发的肾透明细胞癌患者带来了希望，如西罗莫司靶蛋白 (mammalian targeting of rapamycin, mTOR)激酶抑制剂西罗莫司和依维莫司、多靶点酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)索拉非尼、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)单克隆抗体阿伐他汀，通过抑制肿瘤细胞的生长和血管的生成达到控制肿瘤的目的，但临床实际效果欠佳，且费用昂贵。由此可见，早发现、早治疗对肾癌患者的预后非常关键。

细胞周期的改变常被认为是肿瘤发生的主要原因[5]。miRNA是由22～24个碱基对组成的小片段非编码单链RNA，具有高度保守性，参与细胞的分化、生长、增殖及凋亡等过程。有研究发现组织中miRNA的差异表达与肿瘤密切相关，miRNA可发挥癌基因或抑癌基因的作用[6]。Mitchell等[3]研究表明血浆及血清中miRNA来源于肿瘤细胞，发现miR-141可作为前列腺癌新的潜在生物标志物，同时发现miRNA对于内源性RNA酶具有高度稳定性，在室温长期放置或反复冷冻解冻的情况下仍能保持稳定。Tsujiura等[8]发现miRNA在原发癌的组织与血浆中表达水平具有一致性。基于miRNA的特点促使其成为肿瘤领域的研究热点，有可能成为潜在的无创检测且稳定的肿瘤标志物。

miRNA常表现为组织特异性，多项研究证实了循环miRNA作为相对无创的肿瘤标记物的价值，如miR-195、let7a可作为乳腺癌的潜在分子标记物[9]，miR-210可作为胰腺癌的潜在分子标记物[10]。本研究发现miR-214在肾透明细胞癌患者的血清中表达升高，在切除肿瘤组织后表达逐渐下降，术后1个月与对照组之间已无统计学差异，可见血清总miR-214有一部分来源于肾透明细胞癌组织，在肿瘤切除后，来源于肿瘤组织的miR-214经代谢消除，使其表达水平逐渐降至正常。肾癌组术前及术后血清miR-214表达变化说明其与肾肿瘤组织密切相关。目前对于miRNA的代谢机制及周期仍未完全明确。本研究表明miR-214的表达量在术后1周虽降低，但与术前无统计学差异，说明其代谢周期较长。相信随着相关机制的深入研究，临床可明确特异性miRNA监测肿瘤或疾病状态的时间原则。

随着研究的进展，发现miRNAs在不同肿瘤亚型及疾病状态中存在差异，如Roth等[11]发现血清miR-10b、miR-34a和miR-155在转移性乳腺癌患者中明显升高，可用于评估肿瘤进展；Asaga等[12]发现血清miR-21在乳腺癌进展的较早期明显升高，可用于肿瘤的分期。因此，循环miRNA有广泛的临床应用前景，可用于对有肿瘤高危因素患者的筛查、术后随访及评价放化疗等辅助治疗的效果评估。

相关研究发现miR-214与细胞的分化、生存、凋亡等具有明显的相关性，在人类不同肿瘤组织中的表达有显著性差异[13-15]。Yang等[14]发现miR-214通过靶向PTEN致其蛋白产物及AKt路径活性降低，进而介导卵巢癌细胞系的存活及对顺铂的抵抗。通过搜索PicTar和miRBase发现PTEN的3′-UTR (nucleotides 3257-3264, NM_000314)与has-miR-214的序列相匹配。Xu等[16]研究发现miR-214靶向于p53。Bartels等[6]证实HeLa细胞系凋亡水平的降低与miR-214被抑制有关。Xiong等[17]研究表明miR-214可在胃癌患者中表达，同时验证了其靶向目标是PTEN。由此可知，miR-214通过作用于不同靶向位点，起到癌基因或抑癌基因的作用。有研究发现不同靶向位点间有密切联系[18]，且miRNA具有组织特异性。本研究发现血清miR-214的表达与肾透明细胞癌间有相关性，但其作用机制是否与PTEN有关，尚需进一步验证。本研究分析了血清miR-214在区分肾透明细胞癌患者和健康人群的价值，根据其表达的差异，利用ROC曲线，计算其AUC=0.858，敏感度为80.0%，特异度为90.0%，考虑其可用于肾透明细胞癌的鉴别诊断。文献报道miRNA表达水平与肿瘤直径相关[19]。本文发现miR-214的表达与性别、年龄、肿瘤直径、Fuhrman分级等无明显相关性，与上述结果不符，可能与样本量较小有关。目前对于miRNAs表达尚无统一标准。Kirschner等[20]发现miR-16和miR-451常被用作管家基因，在红细胞中含量很高，在血液凝固后血清中的表达量有较大的差异。本研究虽使用U6作为内参基因，但仍不是理想的管家基因，因此今后需更严谨的大样本研究来比较、印证。

综上，血清miR-214与肾透明细胞癌的发生、发展密切相关，可作为潜在的生物学标记物。

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L,etal. Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Ljungberg B, Cowan N C, Hanbury D C,etal. EAU guidelines on renal cell carcinoma: the 2010 update[J].Eur Urol, 2010,58(3):398-406.

[3] Mitchell P S, Parkin R K, Kroh E M,etal. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(30):10513-10518.

[4] Jiang Z, Chu P G, Woda B A,etal. Combination of quantitative IMP3 and tumor stage: a new system to predict metastasis for patients with localized renal cell carcinomas[J].Clin Cancer Res, 2008,14(17):5579-5584.

[5] Collins K, Jacks T, Pavletich N P. The cell cycle and cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(7):2776-2778.

[6] Bartels C L, Tsongalis G J. MicroRNAs: novel biomarkers for human cancer[J].Clin Chem, 2009,55(4):623-631.

[7] Störkel S, Eble J N, Adlakha K,etal. Classification of renal cell carcinoma: Workgroup No.1. Union International Contre Ie Cancer (UICC) and the American Joint Committee on Cancer (AJCC)[J].Cancer, 1997,80(5):987-989.

[8] Tsujiura M, Ichikawa D, Komatsu S,etal. Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers[J].Br J Cancer, 2010,102(7):1174-1179.

[9] Heneghan H M, Miller N, Lowery A J,etal. Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer[J].Ann Surg, 2010,251(3):499-505.

[10]Ho A S, Huang X, Cao H,etal. Circulating miR-210 as a Novel Hypoxia Marker in Pancreatic Cancer[J].Transl Oncol, 2010,3(2):109-113.

[11]Roth C, Rack B, Muller V,etal. Circulating microRNAs as blood-based markers for patients with primary and metastatic breast cancer[J].Breast Cancer Res, 2010,12(6):90.

[12]Asaga S, Kuo C, Nguyen T,etal. Direct serum assay for microRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer[J].Clin Chem, 2011,57(1):84-91.

[13]Flynt A S, Li N, Thatcher E J,etal. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate[J].Nat Genet, 2007,39(2):259-263.

[14]Yang H, Kong W, He L,etal. MicroRNA expression profiling in human ovarian cancer: miR-214 induces cell survival and cisplatin resistance by targeting PTEN[J].Cancer Res, 2008,68(2):425-433.

[15]Cheng A M, Byrom M W, Shelton J,etal. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis[J].Nucleic Acids Res, 2005,33(4):1290-1297.

[16]Xu C X, Xu M, Tan L,etal. MicroRNA miR-214 regulates ovarian cancer cell stemness by targeting p53/Nanog[J].J Biol Chem, 2012,287(42):34970-34978.

[17]Xiong X, Ren H Z, Li M H,etal. Down-regulated miRNA-214 induces a cell cycle G1 arrest in gastric cancer cells by up-regulating the PTEN protein[J].Pathol Oncol Res, 2011,17(4):931-937.

[18]Catto J W, Alcaraz A, Bjartell A S,etal. MicroRNA in prostate, bladder, and kidney cancer: a systematic review[J].Eur Urol, 2011,59(5):671-681.

[19]Zhao A, Li G, Péoc'h M,etal. Serum miR-210 as a novel biomarker for molecular diagnosis of clear cell renal cell carcinoma[J].Exp Mol Pathol, 2013,94(1):115-120.

[20]Kirschner M B, Kao S C, Edelman J J,etal. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma[J].PLoS One, 2011,6(9):24145.

Expression and Clinical Significance of Serum miR-214 in Patients with Clear Cell Carcinoma of Kidney

HE Jiang-wei , Halmurat·Tusong, WANG Yu-jie, WANG Wen-guang

(Department of Urinary Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)

Objective To investigate expression of serum miR-214 in patients with clear cell carcinoma of kidney and its clinical significance in diagnosis, therapy and prognosis judgement. Methods A total of 30 patients with clear cell carcinoma of kidney were selected as renal cancer group, and 30 healthy people taking medical examination at the same period were chosen as control group, and miR-214 expressions were detected by randomized method in control group, and the expressions were detected before surgery, 1 week and 1 month after surgery in renal cancer group, and then expression differences and correlations with clinical indexes were compared between two groups. Results The differences of relative miR-214 expressions before and 1 week after surgery in renal cancer group and in control group were statistically significant (P<0.05). The differences of miR-214 expressions were statistically significant between before surgery and 1 month after surgery, and between 1 week after surgery and 1 month after surgery in renal cancer group (P<0.05). The differences of miR-214 expressions were not statistically significant between before and 1 week after surgery in renal cancer group, and between 1 month after surgery in renal cancer group with in control group (P=0.318，P=0.383). Diagnostic test was performed by using receiver operating curve (ROC), and area under curve (AUC) was 0.858 [95%CI (0.756, 0.960)，P<0.05]. The best diagnostic point, sensitivity and specificity were 2.91, 80.0% and 90.0% respectively according to Youden index. Conclusion Expressions of serum miR-214 in patients with clear cell carcinoma of kidney have correlation with clear cell carcinoma of kidney, and therefore it can be used as a potential molecular marker.

MicroRNAs; Clear cell carcinoma of kidney; Tumor markers, biological

自治区自然科学基金资助项目(2013211A101)

830054 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院泌尿外科[何江伟(在读研究生)]

王玉杰，E-mail:wangyj-mr@vip.sina.com

R737.11

A

1002-3429(2017)03-0084-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.03.032

2016-12-12 修回时间：2017-01-13)