RegⅣ、EGFR和Survivin在结直肠腺瘤癌变过程中的表达及意义*

王林娜，张清泉，侯素平，刘洪博

（河北省衡水哈励逊国际和平医院，河北 衡水 053000）

RegⅣ、EGFR和Survivin在结直肠腺瘤癌变过程中的表达及意义*

王林娜，张清泉，侯素平，刘洪博

（河北省衡水哈励逊国际和平医院，河北 衡水 053000）

目的研究再生基因Ⅳ（RegⅣ）、表皮生长因子受体（EGFR）及Survivin在结直肠腺瘤癌变过程中的表达，并分析其与结直肠腺瘤及结直肠癌临床病理特征的关系。方法 采用免疫组织化学结合组织芯片法检测结直肠正常黏膜（150例）、腺瘤（77例）、结直肠癌（150例）RegⅣ、EGFR及Survivin的表达，并分析其与临床病理特征的关系。结果 RegⅣ、EGFR、Survivin在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织中，表达逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。RegⅣ、Survivin与结直肠腺瘤大小及分级相关，EGFR仅与腺瘤的分级相关；RegⅣ、EGFR与结直肠癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，Survivin与结直肠癌的淋巴结转移及TNM分期密切相关（P＜0.05），而3者与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤大小及浸润深度无关（P＞0.05）。结直肠腺瘤组织内RegⅣ、EGFR、Survivin 3者无相关性（P＞0.05）；结直肠癌组织内RegⅣ与EGFR、RegⅣ与Survivin、EGFR与Survivin表达呈正相关（P＜0.05）。结论 RegⅣ、EGFR及Survivin在结直肠腺瘤癌变过程中逐渐升高，提示3者共同参与结直肠腺瘤癌变的发生，且与结直肠癌的TNM分期密切相关，联合检测有利于对结直肠癌的预后进行评估，并为研发靶向药物提供理论支持。

结直肠腺瘤；癌变；再生基因Ⅳ；表皮生长因子受体；Survivin；组织芯片

结直肠癌是消化系统恶性肿瘤之一，发病率居我国恶性肿瘤的第1位[1]，在美国发病率与病死率均居第3位[2]。研究结直肠癌的发病机制对其预防、治疗及预后均有重要意义。结直肠癌发生机制复杂，其中腺瘤癌变是已被广泛认可的途径之一，但其机制目前尚不明确。再生基因Ⅳ（regenerating islet-derived family memberⅣ，RegⅣ）是再生基因家族最小的一员，参与多种恶性肿瘤的形成，如胰腺癌[3]，胃癌[4]，结直肠癌等[5]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）参与多条与结直肠癌有关的信号通路，同时EGFR/Akt通路下游因子生存素（Survivin）是凋亡抑制家族（inhibitor of apotosis，IAP）效力最强的成员，两者与结直肠癌密切相关。BISHNUPURI等[6]研究发现，RegⅣ发挥着类似表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）的功能，可与EGFR结合，上调Survivin的表达，参与结直肠癌的发生、发展。本研究旨在通过组织芯片结合免疫组织化学法，检测RegⅣ、EGFR及Survivin在结直肠腺瘤癌变过程中的表达及其相关性，并分析3者与临床病理特征的关系，以探讨3者在结直肠腺瘤癌变过程中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年1月-2015年12月本院结直肠癌患者手术标本及肠镜结直肠腺瘤病理标本。所有病理切片由两位高年资病理医师严格按照2000年世界卫生组织标准进行明确诊断，选择结直肠正常黏膜（150例）、腺瘤（77例）、结直肠癌（150例）为研究对象。患者术前均未接受抗肿瘤治疗。结直肠癌患者中男性98例，女性52例；年龄18～90岁，中位年龄64岁；组织学分级：高分化28例，中分化80例，低分化42例；浸润未达全层44例，全层106例；淋巴结未转移84例，转移66例；病理分期（pTNM分期）：Ⅰ期34例，Ⅱ期57例，Ⅲ期53例，Ⅳ期6例。

1.2 实验方法

1.2.1 组织芯片复制 显微镜下在苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）切片上标记，选取结直肠癌组织和正常组织各2点，并在蜡块对应位置上标记。取组织芯片空白蜡块，用骨髓穿刺针在蜡块上打孔，将标记好的组织用骨髓穿刺针穿取，并按设计的排列顺序装载在空白蜡块中。将组织芯片蜡块左上角位点放置肠壁平滑肌组织作为标记。制备好的蜡块在52℃烤箱中加热融合，冷却备用。

1.2.2 免疫组织化学法染色 组织芯片蜡块行4 μm连续切片，60℃恒温烤箱烤片60 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温10 min阻断内源性过氧化物酶，分别用柠檬酸盐缓冲液高压修复RegⅣ和EDTA高压修复EGFR、Survivin，山羊血清室温封闭20 min，一抗4℃过夜（RegⅣ稀释1∶100；EGFR、Survivin工作液），二抗37℃恒温箱内40 min。二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染。每批均设阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲溶液替代一抗作为阴性对照。RegⅣ兔抗多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，EGFR兔抗单克隆抗体、Survivin兔抗多克隆抗体、即用型SP通用试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判定

RegⅣ和Survivin定位于细胞浆，EGFR阳性表达于细胞膜，染色结果依据染色强度和阳性细胞数评分。即随机选取10个高倍镜视野，计数阳性细胞百分比的平均数，阳性细胞数计分：无为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；着色强弱计分：无为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞数计分和着色强弱计分的乘积评定，≤3分者为阴性，＞3分者为阳性。染色结果均由2位病理医师双盲评估。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料以率表示，用χ2检验；相关性分析用Spearman法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RegⅣ、EGFR和Survivin在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织内的表达

RegⅣ、Survivin蛋白阳性表达定位于细胞浆，EGFR主要表达于细胞膜和/或细胞浆。在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织中RegⅣ阳性表达率分别为3.3%、33.8%和52.0%；EGFR阳性表达率分别为5.3%、35.1%和59.3%；Survivin阳性表达率分别为2.7%、40.3%和64.7%。RegⅣ、EGFR和Survivin 3者在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织内表达逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图1～3。

图1 RegⅣ在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织的表达 （×200）

图2 EGFR在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织的表达 （×200）

图3 Survivin在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织的表达 （×200）

表1 结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织RegⅣ、EGFR、Survivin的表达 例（%）

2.2 RegⅣ、EGFR和Survivin表达与结直肠腺瘤临床病理特征的关系

RegⅣ与结直肠腺瘤的大小及分级相关（χ2= 4.900和8.183，P=0.027和0.004），Survivin与结直肠腺瘤的大小及分级相关（χ2=5.402和5.998，P= 0.020和0.014），EGFR仅与结直肠腺瘤的分级相关（χ2=4.663，P=0.031）；而3者与患者的性别、年龄、腺瘤的部位及类型无关（P＞0.05）。

2.3 RegⅣ、EGFR和Survivin表达与结直肠癌临床病理特征的关系

RegⅣ、EGFR与结直肠癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关（P＜0.05），Survivin与结直肠癌的淋巴结转移及TNM分期相关（P＜0.05）；3者与患者的性别、年龄、肿瘤大小及浸润深度无关（P＞0.05）。见表2。

2.4 RegⅣ、EGFR和Survivin在结直肠腺瘤及癌组织内表达的相关性

Spearman相关性分析结果显示，在结直肠癌组织内，RegⅣ与EGFR、EGFR与Survivin、RegⅣ与Sur-vivin呈正相关（r=0.427、0.439和0.267，P=0.000、 0.000和0.001）。

表2 临床病理特与RegⅣ、EGFR及Survivin在结直肠癌组织中表达的关系 例（%）

3 讨论

结直肠癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤，严重威胁人类健康和生活质量，但其发病机制尚不明确[1]。正常黏膜-腺瘤-癌的发生顺序被多数学者认可，系统研究该顺序内基因或蛋白的改变，对探索腺瘤癌变及结直肠癌发生机制可能有重要作用。RegⅣ是再生基因家族新近发现的一员，参与多种恶性肿瘤的发生，尤其是胃肠道的肿瘤，但在结直肠腺瘤癌变内的研究目前较少。ZHANG等[7]构建结肠正常黏膜-腺瘤的差减文库，RegⅣ被筛选13次，通过逆转录聚合酶链反应、Northern、原位杂交检测12例癌与腺瘤并存的患者，RegⅣ在腺瘤组织内表达均显著升高，并且在腺瘤癌变组织中丰度最高[8]，提示RegⅣ在结直肠腺瘤癌变过程中发挥一定的作用，检测腺瘤内RegⅣ水平，可能预示其更有癌变的趋势。ZHU[9]和SAWADA等[10]认为，RegⅣ过表达预示着结直肠癌患者有更差的预后，本实验结果显示，RegⅣ在正常黏膜-腺瘤-癌这一发生过程中表达逐步升高，3者比较差异有统计学意义；且RegⅣ与结直肠癌的临床特征相关性分析显示，其与组织学分化、淋巴结转移及临床分期密切相关，与ZHU[9]及KAWASAKI等[11]研究结果一致。

EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，参与细胞内多种信号转导途径，与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，同时EGFR在多种肿瘤发生过程中发挥重要作用。EGFR也参与结直肠腺瘤癌变该过程。IVANCIC等[12]通过检测APC pirc/+小鼠血浆内EGFR浓度发现，EGFR浓度与结肠腺瘤形成有较好的相关性。LEUNG等[13]检测氧化偶氮甲烷处理的小鼠亦发现，EGFR与结肠腺瘤的发生率密切相关。ISIDRO等[14]通过免疫组织化学法检测发现，结直肠癌组织内的EGFR表达显著高于正常黏膜。崔红霞等[15]检测发现，结直肠癌组织内EGFR的表达显著高于正常黏膜及腺瘤组织，且EGFR的表达与结直肠癌的组织学分级相关。本实验中EGFR在结直肠正常黏膜-腺瘤-癌组织内表达逐步升高，且差异有统计学意义，提示EGFR在结直肠腺瘤癌变过程中发挥一定作用。EGFR与临床病理特征相关性分析显示，其与癌组织的分化程度及淋巴结转移、肿瘤临床TNM分期关系密切，题示预后较差。目前临床已常规检测肿瘤组织内EGFR的表达情况，提示预后并且指导用药。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一员，也是目前发现凋亡作用最强因子，可通过多种途径抑制细胞凋亡，参与肿瘤的发生。赵成鹏[16]通过免疫组织化学法分析结直肠腺瘤及癌组织内Survivin的表达，结果显示，其在结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织内表达差异有统计学意义；并提出在检测腺瘤伴低级别内瘤变时，若Survivin为阳性，则提示其正在进展期，应密切随诊。ADAMKOV等[17]检测结直肠腺瘤伴高级别内瘤变及伴低级别内瘤变内Survivin的表达情况，发现前者要明显高于后者，Survivin的表达与腺瘤的大小，分级及部位相关。笔者实验检测结直肠正常黏膜、腺瘤及癌组织内Survivin的表达差异有统计学意义，并且Survivin与淋巴结转移及临床分期相关，与上述结果一致，说明Survivin参与结直肠腺瘤癌变的过程，同时提示预后不良。Survivin在正常成熟组织内基本不表达，而在结直肠癌组织内过表达，笔者可通过这一特性，设计有关于Survivin的靶向药物。MOBAHAT等[18]也认为Survivin可以作为癌症治疗优先选择的靶向药物。

BISHNUPURI等[6]发现，HCT116和HT29细胞系对rhR4反应与加入EGF后的反应相似，推测RegⅣ可能是通过EGFR/Akt/AP-1通路发挥作用。RTPCR及Western blot检测显示，加入rhR4后，可导致Survivin的表达升高，推测RegⅣ、EGFR及Survivin 3者可能存在信号通路的交汇，并互相影响。笔者通过组织芯片结合免疫组织化学法，检测结直肠正常黏膜、腺瘤、癌组织内RegⅣ、EGFR、Survivin的表达，3者的表达逐步升高，且差异有统计学意义；同时在结直肠腺瘤内，伴有高级别内瘤变的表达率要高于伴有低级别内瘤变的组织，说明3者在腺瘤时期表达也在发挥促进癌变的作用。在分析3者在癌组织内相关性时发现，3者两两呈正相关，但在腺瘤内未发现相关性，说明可能在结直肠癌发生早期，3者在各自发挥作用，到腺瘤癌变后，才通过某些其他因子发生连系。同时，3者与临床病理特征的相关性也说明可通过检测RegⅣ、EGFR、Survivin的表达，来预测结直肠癌患者的预后，并对指导临床靶向药物治疗有重要意义。

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（童颖丹 编辑）

Expression and significance of RegⅣ,EGFR and survivin in canceration of colorectal adenoma*

Lin-na Wang,Qing-quan Zhang,Su-ping Hou,Hong-bo Liu
(Harrison International Peace Hospital,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of regenerating islet-derived family memberⅣ (RegⅣ), epidermal growth factor receptor (EGFR)and survivin in canceration of colorectal adenomas and analyze the correlations with clinicopathological features.Methods Immunohistochemistry combined with tissue microarray was used to detect the expressions of RegⅣ,EGFR and survivin in normal colorectal mucosa from 150 cases, colorectal carcinomas from 150 cases,and adenomas from 77 cases.The relationships among RegⅣ,EGFR, survivin and clinicopathological features were statistically analyzed.Results The positive rates of RegⅣ,EGFR and survivin in the colorectal adenomas and the colorectal carcinomas were significantly higher than those in the normal mucosa(P＜0.05).The expressions of RegⅣ and survivin were positively correlated with adenoma size and degree of dysplasia,while EGFR only correlated with dysplasia grade of adenomas.The expressions of RegⅣ and EGFR in the colorectal carcinomas were significantly correlated with differentiation,lymph node metastasis and TNM stage,while the expression of survivin had positive correlations to lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05),but none of them was associated with patients'gender,age,tumor size or depth of invasion (P＞0.05).There was no correlation among RegⅣ,EGFR and survivin expressions in the adenomas, while the RegⅣ,EGFR and survivin expressions in the colorectal carcinomas were positively correlated (P＜0.05).Conclusions RegⅣ,EGFR and survivin are up-regulated in colorectal adenomas and carcinomas,which indicates that they may play important roles in the canceration of colorectal adenomas and are closely correlated to TNM staging of colorectal carcinomas.Combined detection of the three markers possibly has certain referential value in evaluation of the prognosis of colorectal adenomas and carcinomas,and in developing the target medicine for colorectal carcinomas.

colorectal adenoma;carcinogenesis;regenerating islet-derived family memberⅣ;epidermal growth factor receptor;survivin;tissue microarray

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.009

1005-8982（2017）06-0044-06

2016-06-07

河北省卫生厅医学科学重点课题（No：20130341）