硬皮病分子机制研究进展

刘庆梅+楚海燕+姜帅+鲁佳莹+朱兴宇+石祥广+吴文育+邹和建+王久存

摘 要 硬皮病是以皮肤及内脏器官纤维化为特征的自身免疫性疾病。目前，硬皮病发病机制尚不明确，且治疗手段有限，效果欠佳。研究表明，血管病变、自身免疫反应和胶原沉积是导致硬皮病产生多系统损害的3大因素。

关键词 硬皮病 纤维化 分子机制

中图分类号：R593.25 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）S1-0022-05

Advances in the molecular mechanism of systemic sclerosis*

LIU Qingmei1，2**， CHU Haiyan1， JIANG Shuai1， LU Jiaying2， ZHU Xingyu1， SHI Xiangguang1， WU Wenyu2， ZOU Hejian3， WANG Jiucun2***（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China； 2. Division of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China； 3. Institute of Rheumatology， Immunology and Allergy， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Systemic sclerosis（SSc）is an autoimmune disease which is characterized by the fibrosis of skin and internal organs. The pathogenesis of SSc is still unknown till now and there are limited therapies and poor efficacy. Current studies have shown that vascular injury， autoimmune reaction and collagen deposition are the most important factors leading to multi-system damage of SSc.

KEY WORDS scleroderma； fibrosis； molecular mechanism

硬皮病（scleroderma），即系統性硬化（systemic sclerosis， SSc），是以皮肤增厚和纤维化为特征并累及内脏器官，同时伴有微血管系统损害的自身免疫性疾病[1-3]。可分为较少侵犯内脏的肢端型硬皮病（limited cutaneous scleroderma，lcSSc）和常伴系统损害的弥漫型硬皮病（diffuse cutaneous scleroderma，dcSSc）。硬皮病患者症状轻的可致残、毁容，重的可导致死亡。血管病变、自身免疫反应和皮肤、内脏组织中的胶原纤维增生是导致硬皮病产生多系统损害的3大因素。但其中的具体机制尚不完全清晰，以致其治疗效果不理想。因此，深入探索硬皮病发病机制具有重要的意义，硬皮病分子机制的研究已成为临床及科研工作者共同关注的重要课题。

1 硬皮病血管损伤病变的分子机制研究

病理学检查发现SSc患者早期即有微血管内皮细胞的破坏。血管损伤的组织病理学证据在纤维化前就存在，血管受累表现（如雷诺现象）常出现在其他临床表现之前。研究显示，内皮细胞损伤可能是SSc发病的始动因素之一[4]。硬皮病的血管病变是遗传因素及环境因素等各种原因（如氧化压力、外伤）引起的免疫复合物介导的免疫损伤，血液中的免疫复合物沉积于血管壁，激活补体，通过氧化应激以及抗体产生等途径，损伤血管内皮细胞。内皮细胞损伤及功能障碍 ，势必导致 E C 分泌功能失调，表现为舒血管物质与缩血管物质比例平衡发生改变。研究显示，从硬皮病患者分离出的皮肤微血管内皮细胞分泌NO量明显减少，缩血管物质ET-1等增加，并且随着病程的进展，ET-1也随之增加。损伤的内皮细胞可释放细胞因子、化学因子并改变自身通透性，加速单核细胞等炎症相关的细胞渗透，再激活成纤维细胞从而产生大量的胶原蛋白等细胞外基质成分，同时细胞外基质降解减少，导致器官组织内大量细胞外基质沉积，引起器官纤维化[5]。疾病晚期，血管平滑肌细胞增生、纤维蛋白广泛沉积以及血管周围纤维化导致进行性官腔闭塞，血供减少导致组织慢性缺氧，进一步引起血管内皮细胞等一系列细胞凋亡，造成组织损伤。且损伤组织中的小血管明显减少，甚至出现无血管区域。临床中广泛出现的小动脉中等大小动脉的增殖性/闭塞性血管病变是所有类型SSc的病理学标志[6]。

内皮素-1是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质，不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。相关研究已表明，升高的血浆内皮素水平与系统性硬皮病肺纤维化程度呈正相关。应用波生坦阻断内皮素-1受体双通路可以有效延缓硬皮病疾病进展、降低死亡率，尤其对并发间质性肺纤维化硬皮病患者的疗效明显[7]。NO是很强的扩血管分子，可以抑制ET-1的生物学作用。目前，多个研究报道SSc中NO的产生受损[8]。

2 硬皮病炎症及免疫异常反应的分子机制研究

在硬皮病发病初期，甚至在纤维化发生之前，受感染的组织就发生了巨噬细胞、肥大细胞以及淋巴细胞的浸润。急性炎症的发生及抗原的呈递进一步引起获得性免疫的异常改变，并有一系列研究证实，免疫细胞是导致纤维化的众多复杂的分子及生化过程的起始因素。迄今研究表明，外界感染可引起急性炎症和固有免疫反应的发生，进而诱发获得性免疫的失衡，氧化压力、外伤等可引起血管内皮细胞或上皮细胞损伤。通过固有免疫细胞的呈递以及损伤的内皮细胞释放细胞因子、化学因子，引起CD4+ T淋巴细胞浸润，调节Th1/Th2及Th17/ Treg亚群的比例与功能，释放多种炎症细胞因子，同时引起自身免疫性B细胞的活化以及细胞间的相互作用，产生自身抗体。免疫系统的失衡进一步激活成纤维细胞从而产生大量的胶原蛋白等细胞外基质（extracellular matrix， ECM），同时ECM合成与分解失衡，导致器官组织内大量ECM沉积，引起器官纤维化。

2.1 免疫细胞活化与失衡

2.1.1 单核/巨噬细胞的活化

SSc发病初期巨噬细胞的活化以及肥大细胞等脱粒会引发病灶的急性炎症反应，SSc患者皮肤组织中巨噬细胞是主要的免疫细胞浸润类型[9]。之后组织中的巨噬细胞及循环系统中的单核细胞会进一步活化，分泌大量的炎症因子。I型干扰素是分泌的主要细胞因子，患者血浆中的I型干扰素的含量显著高于正常人，且干扰素诱导基因（ISGs）在患者的外周血中高表达，暗示I型干扰素的升高在硬皮病发生和发展中起重要作用[10]。

2.1.2 T细胞的活化

SSc早期的皮肤活检显示，皮肤血管周围有T淋巴细胞和单核细胞浸润，部分患者有肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润[9]，肺累及的硬皮病患者的肺部活检同样发现有T细胞浸润。Kalogerou等[11]观察到在硬皮病患者皮肤组织中浸润T细胞的活化，且活化的细胞表面标志表达也增加，如IL-2R和CD69。同时，活化的T细胞释放的细胞因子如IL-4和IL-17也随之增加[12]。

2.1.3 Th1/Th2平衡

基于T细胞分泌的细胞因子，T细胞可分为Th1型和Th2型细胞。Th1与Th2型细胞因子在炎症性疾病中发挥重要作用，Th1型细胞主要分泌细胞因子IL-2和干扰素-γ（IFN-γ），而Th2型细胞主要产生促炎因子IL-4，IL-13和IL-5。硬皮病患者体内Th2型细胞是主要的活化细胞类型，在患者皮肤、肺及外周血中产生大量的促炎及促纤维化因子IL-4和IL-13。Th1/Th2平衡和硬皮病活动度有关[13]。体内体外研究表明，Th1反应在介导SSc早期的炎症过程中发挥重要作用，而Th2活跃可促进纤维化的形成，后者在活化成纤维细胞、促进胶原等ECM生成和沉积中发挥更显著的作用[14]。

2.1.4 Th17/Treg平衡

Th17主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，誘导产生其他细胞因子和趋化因子（如IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子等），对固有免疫和获得性免疫炎症均有促进作用，Th17细胞介导的大多数反应都通过IL-17A实现，IL-17A常被称作IL-17。另一方面，调节性T细胞（Tregs）在免疫应答反应中发挥重要作用。Foxp3基因特异表达于CD4+CD25+T细胞表面，直接参与CD4+T细胞向Treg细胞的分化，通常所说的Treg细胞就是CD4+CD25+Foxp3+T细胞。Treg与Th17之间存在反作用关系。Radstake等[15]报道，SSc患者的外周血CD4+ T细胞群中辅助性T细胞17（Th17）亚群比例增多，虽然在SSc外周血中Treg细胞数量也增多，但Treg细胞的功能受损[16]。万琳琳等[17]也认为，Th17/Treg与SSc病情相关，Th17细胞亚群在活动期SSc患者体内增殖，其增殖程度与SSc活动度密切相关。这些线索提示，炎症导致的硬皮病纤维化很可能与Th17/Treg亚群的平衡有关。

2.1.5 B细胞的活化

利用芯片技术分析发现，SSc皮损中一系列与B细胞有关的基因表达上调[18]。此外，在SSc中，外周血中B细胞的稳态及亚类表现异常：幼稚B细胞增多而记忆B细胞及早期浆细胞减少，虽然硬皮病的记忆B细胞数量减少但其产生抗体的能力增强，且SSc患者的记忆B细胞在体内长期处于活化状态[19]。活化的B细胞可分泌IL-6和IL-10，诱导Th2型免疫反应[20]。同时，活化的B细胞可高表达MHC II类分子和共刺激分子，与树突状细胞有相似的抗原呈递能力，但树突状细胞可通过产生IL-12而激起Th1型反应[21]。活化的T细胞也可与B细胞相互作用，促进B细胞产生各种自身抗体。综上所述，SSc中存在B细胞的活化，并且活化的B细胞可能是SSc自身抗体的来源，同时活化的B细胞可能通过调节辅助T细胞的平衡及细胞因子的产生进而促进纤维化的发生。

2.2 促炎症因子

活化的T细胞不仅可直接与成纤维细胞相互作用还可以通过间接方式作用于成纤维细胞，即通过分泌各种促炎因子。IL-6是促炎促纤维化因子，可由T细胞、单核细胞、内皮细胞及成纤维细胞产生。IL-6在硬皮病内皮细胞功能紊乱和纤维化形成中有重要作用，硬皮病患者血清中IL-6水平显著升高，且皮损处IL-6表达明显增加[22]。IL-6可促进胶原的产生并可增强Th2型细胞分化，且在T细胞分化过程中IL-6可诱导T细胞发展为Th17细胞，促进炎症的发生[23]。IL-4和IL-13是Th2型细胞因子，SSc患者IL-4和IL-13等细胞因子水平显著上升[24-25]。体外实验同样表明，IL-13是成纤维细胞增殖和胶原沉积的潜在调节因子[26]。IL-4是一种多能性的细胞因子，可刺激与成纤维细胞增殖相关的基因表达及促进ECM蛋白合成[27]。此外，SSc患者血浆及皮损中肿瘤坏死因子TNF-α水平显著升高[28]，而TNF-α具有聚集炎症细胞及刺激成纤维细胞增殖、促进胶原合成等功能[29]。

S100A8、S100A9是S100钙结合蛋白家族中的重要成员，主要由髓系来源细胞如单核细胞、中性粒细胞和分化早期的巨噬细胞分泌，与机体炎症及免疫功能有关。本项目组酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测结果发现 ，S100A8、S100A9在弥漫型硬皮病患者血浆中的表达显著升高。S100A8、S100A9表达水平与硬皮病患者的器官累及、免疫学特征相关，可能影响了疾病发展的进程。我们进一步研究发现，S100A9可协同博莱霉素诱导小鼠的皮肤炎症及纤维化反应，S100A9可通过活化ERK1/2和NF- κB通路单独诱导小鼠皮肤炎症及纤维化反应。S100A9可激活NF-κB信号通路，诱发炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β的表达增加，促进肌成纤维细胞的增殖活化，导致胶原纤维增生。这些研究证明，炎症因子S100A9参与了硬皮病的发生与发展[30-31]。

3 硬皮病纤维化发生的分子机制研究

3.1 成纤维细胞增殖与活化

胶原是纤维化组织的主要成分，人体合成胶原的最主要场所是成纤维细胞，故成纤维细胞的数量及活性与胶原的合成密切相关。成纤维细胞活化后表达更多的胶原以及促纤维化因子，国内外研究均显示，体外培养的系统性硬化病（SSc）患者的皮肤成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的量明显增加。

3.2 促纤维化因子

转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）是硬皮病发生及发展过程中作用最强的促纤维化细胞因子之一，在组织纤维化产生的病理机制中起重要作用，可刺激细胞产生大量的细胞外基质，包括胶原蛋白、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF）等，并抑制细胞外基质降解酶（MMP）的活性，增加这些降解酶抑制物（TIMP）的活性，降低细胞外基质的降解能力，导致细胞外基质产生和降解的不平衡，从而引起纤维化[32]。Smad是 TGF-β最重要的胞内信号转导分子，TGF-β与细胞表面受体复合物结合引起胞内 Smad2 和Smad3的磷酸化作用，并且与Smad4 形成复合物转运至细胞核，调控相关基因的转录。已有的研究表明，Smad信号传导路径在硬皮病的发病过程中起着重要作用。此外，除了Smad依赖的TGF-β信号通路，TGF-β还可激活Smad非依赖的信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase， MAPK）信号通路等。

CTGF、PDGF、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、HSP47、LTBP-4等作为促纤维化因子与肌成纤维细胞的活化、纤维化的发生存在密切关系。上述细胞因子在硬皮病中主要作用如下：

1）CTGF在纤维化的发生过程中是一个重要的细胞因子，TGF-β是调控其转录的最强、最直接的刺激因子[33]。纤维化的组织中CTGF表达增加，在硬皮病的成纤维细胞培养基中CTGF表达也增加，此外，在系统性硬皮患者的血浆中检测到CTGF呈现高水平表达[34]。

2）血小板衍化生长因子（PDGF），是由血小板、巨噬细胞、内皮细胞以及成纤维细胞分泌，刺激成纤维细胞分裂，使成纤维细胞聚集，促进胶原、纤黏连蛋白及蛋白聚糖的合成，在伤口的愈合及纤维化发生中起作用。发现SSc患者的血浆中有PDGFR的抗体，SSc患者的皮损处组织中有大量的PDGF及其受体存在[35]。PDGF还刺激外周血单核细胞向成纤维细胞转化[36]，而选择性地抑制PDGF通路对皮肤成纤维细胞的增殖有抑制作用。

3）富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）是ECM的非胶原糖蛋白中的一种钙结合蛋白，广泛分布于人体的各种组织，尤其是在发育和重建的组织中[37]。来自不同实验室的研究發现，在纤维化患者中SPARC呈明显升高现象，本项目组发现硬皮病患者的成纤维细胞中SPARC的表达显著高于正常成纤维细胞，利用siRNA特异性的抑制SPARC表达可以有效地缓解硬皮病小鼠的皮肤纤维化及肺纤维化[38-39]。因此，作为一种调控组分，SPARC在纤维化的形成中起到了重要的作用。

4）HSP47是分子量为47kD的热激活蛋白，在胶原成熟过程中发挥至关重要的作用，辅助胶原蛋白的正确折叠与修饰[40]。本实验室血清学检测结果显示，SSc患者血浆中HSP47的蛋白水平高于正常对照，同时HSP47 在硬皮病患者外周血细胞中的表达水平高于正常人，且 HSP47的高水平表达与患者血浆中存在 ACA 显著相关。而 ACA 通常存在于肢端型硬皮病患者血清中，且是 SSc 良好预后的标志。免疫组化结果显示， HSP47在硬皮病患者皮肤中表达水平高于正常对照，HSP47 主要表达于分泌胶原的肌成纤维细胞中，说明 HSP47 的表达与胶原的产生相关，且 HSP47的表达受 TGF-β通路调节[41]。

5）TGF-β前体结合蛋白4（latent TGF-beta binding protein-4，LTBP-4 ）作为TGF-β信号通路上游的关键蛋白，可与 TGF-β在细胞内结合形成复合物，并进一步协助TGF-β分泌至胞外，使其在ECM中沉积及储存[42]。本项目组免疫组化结果显示，LTBP-4在硬皮病患者皮损中蛋白表达水平高于正常人，同时LTBP-4在SSc血浆中的表达水平亦显著高于正常人。此外，SSc患者血浆LTBP-4浓度与TGF-β浓度呈正相关，而TGF-β在肺及食管累及的SSc患者血浆浓度均高于无上述器官累及者，提示血浆LTBP-4及TGF-β表达水平可能与硬皮病严重程度密切相关。此外，体外细胞实验结果显示，LTBP-4可通过调控TGF-β信号通路影响皮肤成纤维细胞中胶原蛋白的表达，从而在硬皮病纤维化过程中发挥重要作用[43]。

4 结语

硬皮病发病机制复杂，在遗传及环境因素促发下，血管微循环被破坏，血管内皮细胞损伤，免疫系统紊乱，效应细胞释放多种细胞因子，成纤维细胞激活增殖，胶原等细胞外基质过度沉积，导致组织纤维化。深入探索硬皮病分子机制，将有助于硬皮病等纤维化疾病发生机制的揭示及治疗。

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