中药治疗硬皮病纤维化的分子机制研究

楚海燕+刘庆梅+屠文震+郭刚+吴文育+王久存

摘 要 系统性硬皮病是一种以皮肤及内脏纤维化为显著特征并有微循环改变的免疫性疾病。其病理机制不清晰，尚无FDA批准的有效治疗手段，而中药显示了良好的治疗效果。本文介绍中医治疗硬皮病的基础研究，主要介绍本项目组近年在硬皮病纤维化中药治疗中的研究进展及成果。

关键词 硬皮病 中药 分子机制

中图分类号：R593.25 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）S1-0063-04

Molecular mechanistic investigations into the treatment of Traditional Chinese Medicine for systemic sclerosis-related fibrosis*

Haiyan Chu1**， Qingmei Liu1， 2， Zhenwen Tu3， Gang Guo4， Wenyu Wu2***， Jiucun Wang1****（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438； 2. Department of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai， 200040； 3. Department of Rheumatology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai TCM-integrated Hospital， Shanghai， 200082； 4. Department of Rheumatology， Hebei Yiling Hospital， Shijiazhuang， 050091）

ABSTRACT Systemic sclerosis （Scleroderma， SSc） is a kind of severe autoimmune disease， characterized by fibrosis in skin and visceral organs. The underlying pathogenesis and mechanisms are still unknown. Furthermore， there is no FDAapproved effective therapeutic strategy， whereas traditional Chinese medicine （TCM） appears as a promising approach in SSc treatment recently. Here we review therapeutical benefits and possible mechanisms of TCM for the treatment and prevention of scleroderma-related fibrosis， mainly focusing on the results based on our current studies.

KEY WORDS Scleroderma； Traditional Chinese Medicine； Molecular Mechanism

硬皮病（scleroderma），又稱系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc），是一种复杂的纤维化疾病。自身免疫反应（高免疫球蛋白血症及血清中存在多种自身抗体）、血管病变（小血管内膜损伤以及肢端、内脏频发雷诺现象）和皮肤、内脏组织中的胶原纤维增生是导致硬皮病产生多系统损害的3大因素[1-2]。SSc患病率在结缔组织病中仅次于类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）位居第三位[3]。而内脏器官的纤维化是引起硬皮病患者高死亡率的最重要因素，在美国，硬皮病的5年生存率为50%，与肿瘤相当[4-6]。对于硬皮病，以西药为主的治疗措施效果欠佳或不良反应较大，迄今没有任何美国食品药品管理局（FDA）及我国国家食品药品监督管理局批准的硬皮病治疗药物。因此，寻找效果显著且不良反应小的硬皮病药物已成为当务之急，同时需要对各种候选药物的治疗机制进行深入细致的研究。临床结果显示，中医药治疗硬皮病具有独特的疗效，在一定程度上可改善硬皮病患者的生活质量及生存率，中药作为一种治疗硬皮病的药物逐渐得到人们的重视和认可。

1 硬皮病中医疗效初探

近年来，中药治疗硬皮病取得了较好的疗效，活血化瘀和温阳补肾两类中药对SSc患者皮肤成纤维细胞的增殖影响的研究已为临床组方提供了客观依据。为探讨活血化瘀类中药治疗硬皮病的药理机制，李明等[7]以体外培养的硬皮病患者皮肤成纤维细胞为研究对象，对21种活血化瘀类中药的水溶性提取物对该细胞的影响进行了研究，结果显示，其中17种药物对该细胞增殖具有明显抑制作用[8]。血管内皮细胞的损伤是硬皮病另一重要病理过程，硬皮病的血管病变是免疫复合物介导的免疫损伤，血液中的免疫复合物沉积于血管壁，激活补体，通过一系列途径，损伤血管内皮细胞引发纤维化发生[9]。现代实验和临床研究表明，桃仁、当归、川芎等能降低血液黏度，改善微循环，修复血管内皮损伤，调节免疫功能，并能抑制成纤维细胞亢进的胶原合成，同时对胶原分解有促进作用，从而使硬化的结缔组织软化。

许多研究也已经证明中药单体对纤维化病变有较好的改善。黄芪可以抑制成纤维细胞的分泌功能，减少胶原合成，抑制胶原的沉积。对细胞免疫和抗体生成具有调节作用，能提高毛细血管抗损伤能力，并且有强心利尿、降血压、保肝等作用[10]。丹参的化学成分复杂，其中已经阐明的成分将近50种。其中脂溶性成分主要为丹参酮类型的二萜类化合物，如异参酮Ⅰ、Ⅱ、ⅡB等，隐丹参酮、左旋二氢丹参酮Ⅰ等；水溶性成分主要有丹参素、丹参酸乙、丹参酸丙、丹参酸A、丹参酸C、原二茶醛和迷迭香酸等。已有研究表明[11]，丹参注射液（水溶性提取物）、丹参素及原儿茶醛作用于正常人皮肤成纤维细胞24 h后，对该细胞Ⅰ、Ⅲ 型前胶原mRNA表达具有显著抑制作用，对胶原酶mRNA表达具有显著促进作用，并可通过增加胶原酶的产生或增强胶原酶的活性而促进胶原降解。

2 中药复方治疗硬皮病皮肤纤维化成果

近年来本研究组也对中药作用于硬皮病的疗效及作用机制进行了研究探索，并有以下研究发现。

上海中西医结合医院在临床实践中发现，益气活血中药联合青霉胺小剂量递加疗法治疗系统性硬皮病，对其皮肤硬化、雷诺现象、肺纤维化均有明显的改善，且不良反应较西药组低[12]，在此基础上本实验室探讨了益气活血中药复方在皮肤纤维化小鼠模型上的作用。益气活血复方由黄芪、丹参、当归等12味中药组成。在给予博莱霉素且硬皮病尚未发生的同时（预防组）及只给予博莱霉素发生硬皮病之后（治疗组），分别给与小鼠不同药物治疗，以观察益气活血复方对硬皮病治疗的作用。用益气活血复方治疗模型小鼠，获得目标组织，分别在基因表达水平、蛋白表达水平（胶原蛋白含量）及组织学水平进行检测。结果表明，注射博莱霉素处的小鼠皮肤胶原蛋白的表达及胶原含量显著增加，而预防性给药、治疗给药时复方都可显著降低胶原蛋白等细胞外基质的表达及胶原蛋白的含量以及肌成纤维细胞增殖分化，可缓解病理组织变化。

此外，本项目组培养了硬皮病患者和正常人皮肤成纤维细胞，对比发现硬皮患者细胞可高表达胶原产生的相关基因，而利用复方处理患者成纤维细胞，结果显示，复方可抑制胶原等细胞外基质基因表达和胶原蛋白含量。进而利用TGF-β （transforming growth factor-beita）刺激NIH/3T3成纤维细胞建立的体外硬皮病成纤维细胞模型进行实验，发现复方仍可抑制TGF-β诱导的与胶原产生相关的基因的高表达。在TGF-β信号通路中，SMAD3作为一个重要的信号转导蛋白，其磷酸化水平直接关系着TGF-β信号通路的活性，也就影响着受TGF-β信号通路调节的下游细胞外基质基因的转录活性。另外，在胶原启动子区域包含一段Smad蛋白结合元件（Smadbinding element， SBE）序列，介导了TGF-β信号通路对于胶原基因转录活性的调控。我们检测了SMAD3蛋白在不同处理情况下的磷酸化水平，发现经过中药处理之后SMAD3蛋白的磷酸化水平显著下降，说明中药治疗能够将系统性硬皮病中异常激活的TGF-β信号通路恢复到较为正常的水平。另外，中药处理之后胶原启动子区SBE的活性也显著降低。综上所述，中药可能是通过调节TGF-β信号通路中SMADs蛋白的磷酸化水平，从而降低了胶原基因启动子区SBE的活性，由此降低胶原生成，最终缓解系统性硬皮病纤维化的发生和发展[5]。因此，实验研究证实益气活血复方对硬皮病有独特疗效，并阐明其作用机制是通过抑制TGF-β信号通路而实现抑制皮肤纤维化。

3 中药复方制剂治疗硬皮病肺纤维化研究成果

硬皮病兼具皮肤纤维化和危害性极大的肺纤维化或其它内脏的纤维化，是典型的纤维化疾病。肺是硬皮病常累及的器官之一，肺间质性病变或肺纤维化是硬皮病死亡的主要原因。中医在对肺纤维化的病因、病机、病理变化等理论方面也进行了一定阐明。在中医学中无肺纤维化病名。但其临床表现可散见于中医学古医籍中，本病应归属中医的“肺痹”的范畴[13]。现代医家对本病的病因病机也有一定的认识归纳：早期各种外界邪毒感染机体，造成气虚，而痰淤阻络，津血不足，络虚失养，迁延不愈而导致纤维化发生[14]。已在多种肺纤维化的动物模型上证明丹参、当归、雷公藤、银杏叶制剂等能够明显抑制肺纤维化的发生和发展[15]。

河北以岭医院根据临床经验总结出了对硬皮病患者肺纤维化有显著疗效的参麦开肺散（Shenks）中药制剂，该制剂由西洋参、麦冬、半枝莲等组成，临床实践显示，Shenks能明显改善硬皮病相关肺纤维化患者的临床症状及中医症候如气短、咳嗽、痰量、乏力、舌质和舌苔等，通过调节患者体内促纤维化细胞因子及抑纤维化细胞因子的平衡，从而有效改善纤维化的进程，改善患者肺功能，提高生活质量，同时血、尿、便常规、肝肾功能、心电图和空腹血糖等安全性指标均为正常水平，证明了Shenks的安全性[16] 。

我们建立硬皮病纤维化不同时期的小鼠模型，发现无论是预防性给药还是治疗性给药，Shenks均可有效缓解博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，可抑制肺组织中炎性细胞浸润，胶原纤维蛋白沉积；可显著抑制博莱霉素诱导小鼠肺组织中胶原基因表达；此外，Shenks可抑制促纤维化（Ctgf、Tgf-β）及促炎（Tnf-α、Il-1β）因子的表达，同时可调节基质金属蛋白酶抑制因子-1（metallopeptidase inhibitor 1， Timp1）的表达，提示Shenks可促进胶原蛋白的降解而抑制纤维化发生。同时，本项目选用环磷酰胺为阳性对照药物，以评估Shenks的疗效。结果发现Shenks效果与环磷酰胺相当。在明确Shenks可有效缓解体内外硬皮病相关肺纤维化的基础上，对其治疗机制进行了深入研究。由于正常人体肺组织存在着氧化、抗氧化的平衡，可消除吸入的或炎症细胞释放的氧活性物质。纤维化性肺泡炎时，氧代谢活性产物大量增加，使氧化、抗氧化物质失衡，造成肺组织的氧化损伤，促進肺纤维化的发生[17]。我们针对Shenks在抗氧化损伤方面的功能及机制进行体内、体外实验，结果发现其抑制氧化损伤基因（Nox-4、Rac-1）表达的同时增加抗氧化相关基因（Gclc、Ec-sod）的表达，调节还原型谷胱甘肽（GSH）水平，抑制TGF-β信号通路，降低TGF-β诱导的ROS的产生及氧化损伤（表现为抑制蛋白及脂质氧化损伤产物水平），阻止博莱霉素造成的小鼠肺组织的氧化损伤，从而缓解纤维化。

4 中药单体分子治疗硬皮病纤维化研究成果

在以上研究的基础上，我们还对益气活血复方中主要成分丹参的单体分子对硬皮病纤维化的作用进行了细致的研究[18]。在NIH/3T3成纤维细胞中益气活血复方显著抑制TGF-β增高的SBE活性。进一步检测扣除方及各单方对SBE活性的影响，结果表明，在12味中药中丹参对SBE活性的抑制作用最强，与益气活血复方相当；而益气活血复方扣除丹参后抑制SBE活性的能力显著降低。可见，丹参是益气活血复方抑制TGF-β信号通路的关键成分。而丹酚酸B（salvianolic acid B， SAB）是丹参中含量最高的水溶性组分（约8%），也是目前上市的从丹参中提炼出的唯一的一种单体成分。此外，丹参也是Shenks制剂中的主要成分。

本研究组利用体内、体外实验对其进行了细致研究。体内研究结果显示，SAB抑制博莱霉素诱导的小鼠肺组织炎症细胞浸润，减少肺组织胶原沉积，降低胶原及促纤维化基因表达。体外实验针对3类肺纤维化发生相关细胞进行研究，结果如下：①成纤维细胞是产生细胞外基质的主要细胞，SAB抑制成纤维细胞的增殖，降低TNF-α诱导的细胞炎症基因的表达，且抑制作用可能是通过NF-κB通路而实现，抑制TGF-β增高的胶原表达及促纤维化基因表达，且该作用可能与其抑制TGF-β诱导的ERK及JNK的磷酸化相关；②上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是成纤维细胞的一个来源，对于肺纤维化发生有重要贡献，利用肺上皮细胞A549研究表明，TGF-β联合TNF-α可成功诱导A549细胞发生EMT，而SAB可抑制EMT细胞表型变化及EMT标志基因和蛋白的表达，Western blot 结果显示，SAB可能是通过降低ERK及JNK的磷酸化发挥抑制EMT的作用；③内皮细胞损伤被认为是肺纤维化发生的始动因素，而内皮间充质转化（endothelial-tomesenchymal transition， EndoMT）是成纤维细胞的另一来源，应用H2O2处理EA.hy926细胞建立内皮细胞损伤模型，利用TGF-β处理EA.hy926细胞建立EndoMT细胞模型，内皮细胞研究结果显示，SAB可抑制H2O2诱导的内皮细胞损伤凋亡，增加H2O2抑制的紧密连接相关基因表达，进一步研究表明，SAB可能是通过抑制H2O2诱导ERK信号通路活化从而对内皮细胞的氧化损伤发挥保护作用，此外，显微镜检结果显示，SAB可抑制TGF-β诱导的EA.hy926内皮细胞向间充质细胞表型的转化。因此，SAB有良好的抗纤维化效果且是通过调节促纤维化通路及抑制内皮细胞间质转化而实现。

5 结语

以上研究结果充分显示了中药复方及中药单体在硬皮病纤维化治疗中有着显著的疗效及广阔的临床应用前景。系统性硬皮病属于体内微环境紊乱，从而导致多种器官、系统代谢异常。在中国文化传统中，中医学极为崇尚“阴阳调和”理论，所谓“阴阳”，即指新陈代谢。系统性硬皮病的发生正是因为内稳态受到了严重的扰乱，而中药正是根据“阴阳调和”进行配伍。因此，中药由于其温和的药性及众多成分，兼顾调控纤维化、炎症、氧化应激等一系列通路，能够对系统性硬皮病这一类病因极其复杂的疾病发挥多途径和多靶点的综合作用优势。

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