高糖高脂、PAF对肾小球系膜细胞PKCβI mRNA表达的影响及阿托伐他汀干预作用观察

肖艳华，何笑云，韩晴，胡小文，周素娴

(1桂林医学院，广西桂林541000；2桂林医学院附属医院)

高糖高脂、PAF对肾小球系膜细胞PKCβI mRNA表达的影响及阿托伐他汀干预作用观察

肖艳华1，何笑云1，韩晴1，胡小文1，周素娴2

(1桂林医学院，广西桂林541000；2桂林医学院附属医院)

目的观察阿托伐他汀对高糖高脂、血小板活化因子(PAF)诱导下蛋白激酶C-βI(PKCβI)mRNA表达的影响。方法取培养好的、分化成熟的人肾小球系膜细胞(HMCs)细胞分为A 正常对照组、B 高糖高脂+PAF组、C高糖高脂+PAF+PKCβI抑制剂LY333531组、D高糖高脂+PAF+阿托伐他汀组共4个组。A组加入5.5mmol/L的D-葡萄糖； B组加入30 mmol/L的D-葡糖糖、20 mg/L的溶血磷脂酰胆碱(LPC)和2×10-8mol/L的PAF C-16；C组经2×10-7mol/L的LY333531预处理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-8mol/L的PAF C-16；D组经10 μmol/L的阿托伐他汀处理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-8mol/L的PAF C-16。各组细胞培养24 h后，提取细胞RNA。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中的PKCβI mRNA。结果A、B、C、D组细胞中PKCβI mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、3.59±0.41、2.76±0.57、1.02±0.00。B组细胞中PKCβI mRNA相对表达量高于其余三组，D组PKCβI mRNA相对表达量低于B组和C组(P均<0.05)。结论高糖、高脂、PAF诱导下肾小球系膜细胞中PKCβI mRNA表达上调，阿托伐他汀作用后可抑制PKCβI mRNA表达。

肾小球系膜细胞；血小板活化因子；蛋白激酶C-βI；阿托伐他汀

有20%～40%的糖尿病患者并发糖尿病肾病(DN)[1]。系膜细胞是肾小球滤过屏障主要的组成部分，其形态或功能异常与肾功能损害密切相关[2]。蛋白激酶C(PKC)是一种能影响细胞多条信号通路的蛋白激酶[3]，与细胞生长、分化、凋亡、细胞因子活化及细胞外基质合成密切相关[3]。前期细胞实验发现系膜细胞在高糖、高脂刺激下可大量分泌血小板活化因子(PAF)[4]，PAF通过激活PKCβI促进细胞外基质(ECM)分泌[5]，诱导肾小球硬化的发生。研究还发现HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀不仅可下调高糖、高脂环境下系膜细胞中PAF的表达，还能有效抑制ECM的分泌，延缓肾小球硬化发展[5]。阿托伐他汀对肾脏的保护作用是否与其抑制PAF分泌、降低PKCβI表达、减少ECM分泌有关，目前尚未见报道。为此，本研究观察了高糖、高脂、PAF诱导下肾小球系膜细胞中PKCβI mRNA的表达变化，及阿托伐他汀作用后PKCβI mRNA的表达变化，进一步研究阿托伐他汀对肾脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人肾小球系膜细胞(HMCs)由东南大学孙子林教授赠予，复苏后配制成细胞悬液，分种4个培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2的无菌培养箱中培养。D-葡萄糖购自Biomol公司，溶血卵磷脂购自Sigma公司，人Ⅳ型胶原ELISA试剂盒购自bluegene公司，人纤维连接蛋白ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司，PKCβI引物及逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，GAPDH引物购自上海生工生物工程公司，小牛血清购自GIBCO公司。

1.2 高糖高脂联合PAF诱导及阿托伐他汀给药方法 预实验已筛选最适高糖、高脂浓度、最适PAF浓度、PKCβI抑制剂LY333531最适浓度和阿托伐他汀最适浓度及最适处理时间。取培养好的、分化成熟的HMCs细胞分为A、B、C、D共4个组。A组加入5.5mmol/L的D-葡萄糖；B组加入30 mmol/L的D-葡糖糖、20 mg/L的溶血磷脂酰胆碱(LPC)和2×10-8mol/L的PAF C-16；C组经2×10-7mol/L的LY333531预处理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-7mol/L的PAF C-16；D组经10 μmol/L的阿托伐他汀处理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-7mol/L的PAF C-16。各组细胞再置于37℃、5%CO2的无菌培养箱中培养24 h。实验重复3次。

1.3 系膜细胞中PKCβI mRNA检测 将6孔板中的细胞收集于EP管中，溶解细胞后提取细胞总RNA，并依据逆转录说明书将RNA反转录为cDNA。PKCβI mRNA上游引物序列为5′-GGGGGCGACCTCATGTAT-3′，下游引物序列为5′-GCAATTTCTGCAGCGTAAAA-3′。内参GAPDH上游引物序列为5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物序列为5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。实时荧光定量PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃、10 s，退火56 ℃、20 s，延伸72 ℃、15 s，重复40次。以2-ΔΔCt表示PKCβI mRNA的相对表达量。

2 结果

A、B、C、D组细胞中PKCβI mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、3.59±0.41、2.76±0.57、1.02±0.00。B组细胞中PKCβI mRNA相对表达量高于其余三组，D组PKCβI mRNA相对表达量低于B组和C组(P均<0.05)。

3 讨论

DN为糖尿病患者慢性并发症之一，且为不可逆性病变，随着病情加重，将对患者的生活质量造成严重影响。因此，研究延缓DN发病的药物对糖尿病患者至关重要。糖尿病被认为是一种慢性炎症[6，7]，高糖高脂环境中ECM分泌量大大增加，而PAF作为重要的促炎症因子可进一步促进ECM分泌。PKCβI是细胞质中调控信号通路的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞的分化、凋亡、促进ECM合成等密切相关[8]。PKCβI作为促进肾小球ECM形成通路中重要的一员[7]，其表达量的多少与DN进展密切相关。

本研究结果显示，高糖高脂联合PAF处理可进一步促进PKCβI表达。既往体外细胞实验发现高糖可诱导PKCβI表达[9]，激活PKCβI/TGF-β1途径，进而促进肾小系膜细胞分泌纤黏连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等ECM[10]，同时活化的PKCβI通过阻断胰岛素PI3K通路中胰岛素受体底物的自身磷酸化，导致胰岛素抵抗及肾小球足细胞损伤[11]。动物实验结果显示链脲佐菌素(STZ)诱导的肾小球硬化SD大鼠糖尿病模型中PKCβI mRNA及蛋白表达也相应增加，予PKC-β抑制剂LY333531治疗后PKCβI表达显著下降，同时观察到该组大鼠24 h尿微量白蛋白水平明显下降[12]。体内实验进一步表明PKCβI表达增加与肾功能损害密切相关。

他汀类药广泛应用于临床，具有降低血脂、抗炎[13]、抗氧化[14]、内皮修复等多效性。目前关于阿托伐他汀对DN肾脏的保护机制尚未明确。Han等[15]研究显示使用阿托伐他汀可显著延缓DN患者GRF的下降速度。既往研究表明阿托伐他汀通过降低高糖、高脂环境下系膜细胞中PAF表达及ECM分泌，从而延缓肾小球硬化[16，17]。李文桐等[18]通过诱导大鼠2型糖尿病的实验发现阿托伐他汀可降低大鼠心肌细胞及主动脉中PKCβI的表达，认为阿托伐他汀具有保护血管内皮的作用。另有研究[19]表明阿托伐他汀可通过抑制PKC的表达以减轻内皮细胞在高糖诱导下的氧化应激反应。上述研究均阐明阿托伐他汀保护血管内皮细胞的作用与抑制PKCβ表达有关。我们前期实验已得知PAF、高糖、高脂通过激活PKCβI促进ECM分泌，导致肾小球硬化的发生；而LY333531则通过抑制PAF表达及高糖高脂诱导下PKCβI的表达，对DN具有保护作用[20]。本研究结果显示，经阿托伐他汀预处理(D组)后的系膜细胞中PKCβI mRNA表达量较除A组外的其他各组均显著降低，提示阿托伐他汀对系膜细胞的保护作用可能与抑制PKCβI表达有关。

综上所述，高糖高脂联合PAF诱导下肾小球系膜细胞中PKCβI mRNA表达上调，阿托伐他汀作用后可抑制PKCβI mRNA表达，从而发挥对肾小球系膜细胞的保护作用。然而目前临床糖尿病患者多应用他汀类药物降脂，阿托伐他汀对延缓DN发生是否具有积极意义仍需进一步探索和研究。

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EffectsofhighglucoseandlysophosphatidylcholineandPAFonPKCβImRNAexpressionofglomerularmesangialcellsandtheinterventioneffectofatorvastatin

XIAOYanhua1,HEXiaoyun,HANQing,HUXiaowen,ZHOUSuxian

(1GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of atorvastatin on the PKCβI mRNA expression of high glucose and lysophosphatidylcholine (LPC) and platelet activating factor (PAF)-induced mesangial cells.MethodsHuman glomerular mesangial cells (HMCs) were divided into four groups: the normal control group (group A), high glucose and LPC+PAF group (group B), high glucose and LPC+PAF+LY333531 group (group C), and high glucose and high LPC + PAF+ atorvastatin group (group D). We added 5.5 mmol/L D-glucose to group A; group B was treated with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, and 2×10-8mol/L PAF C-16; group C was pretreated with 2×10-7mol/L LY333531 for 1 h, and then was added with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, and 2×10-8mol/L PAF C-16; group D was pretreated with 10 μmol/L atorvastatin for 1 h, and then was added with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, 2×10-8mol/L PAF C-16. At 24 h after culture, RNA was extracted. The expression of PKCβI mRNA in the mesangial cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe relative expression of PKCβI-mRNA in the groups A, B, C, and D was 1.00±0.00, 3.59±0.41, 2.76±0.57, and 1.02±0.00, respectively. The expression of PKCβI-mRNA in the group B group was higher than that of the other three groups, and the expression of PKCβI-mRNA in the group D was significantly lower than that of the groups B and C (allP<0.05).ConclusionsThe expression of PKCβI mRNA in high glucose and LPC and PAF-induced glomerular mesangial cells is up-regulated, and atorvastatin can inhibit the PKCβI expression.

glomerular mesangial cells; platelet-activating factor; protein kinase C-βI; atorvastatin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.007

R692.6

A

1002-266X(2017)39-0027-03

国家自然科学基金资助项目(81560148，81260134)。

肖艳华(1991-)女，硕士，主要研究方向为糖尿病肾病。E-mail: 770400919@qq.com

周素娴(1976-)，女，硕士，博士生导师，主任医师，主要研究方向为糖尿病肾病。E-mail: zoe_doctor@163.com

2017-06-03)