瘤胃古菌C 簇研究进展

■魏 莎 梁贤威 梁 辛 李孟伟 郭艳霞 杨承剑

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001）

甲烷是主要温室气体之一，其排放总量仅次于二氧化碳，单位质量甲烷的全球增温潜能值是二氧化碳的25倍[1]。全球每年排放的甲烷量约为500 Tg，其中反刍动物排放量占排放总量的15%～25%[2]。在全球家畜的甲烷排放量中，反刍动物占97%[3]。因此，控制甲烷排放是避免全球气候变暖影响加重的关键，而其重点之一在于控制反刍动物甲烷的排放。反刍动物甲烷是由瘤胃内的产甲烷菌生成。当前，反刍动物瘤胃产甲烷菌的研究已引起各国学者的广泛关注。水牛是一种典型的以高粗日粮为主的反刍动物，其产生的甲烷是草食畜牧业生产中甲烷排放总量的重要组成部分[4]。我们实验室通过454平台对摩拉和尼里-拉菲水牛瘤胃甲烷菌区系的研究表明，Methanobrevibacter是优势菌，而Thermoplasma属甲烷菌，即瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC），为第二优势菌。目前对瘤胃Methanobrevibacter属和Methanomicrobiums属甲烷菌进行了大量研究，相比较而言，对Rumen Cluster C的研究还少，其原因在于该属甲烷菌难以采用传统的方法进行分离培养。因此，综合运用传统微生物学，不依赖于培养的分子生物学、宏基因组学和生物信息学等工具研究该类甲烷菌的生理代谢特点对调控反刍动物瘤胃发酵，抑制甲烷生成具有重要意义。本文介绍了RCC近年来的研究成果，为进一步研究RCC的生理代谢机制提供了研究思路。

1 瘤胃古菌C簇

瘤胃微生物是共生在牛、羊、鹿等反刍动物瘤胃中的细菌和原生动物等微生物的总称,包括厌氧性的细菌、真菌、古菌和原虫四大类。近年来，许多研究发现，瘤胃内存在着一大群未分类未培养古菌。这群未培养古菌的序列经常出现在古菌16S rRNA基因文库中[5-8]。由于这群古菌尚未成功分离培养，因此目前大多数相关研究是采用16S rRNA等不依赖培养的分子生物学方法进行。Tajima等[5]通过16S rRNA的分子生物学方法分析牛瘤胃古菌的多样性，其研究首次报道了瘤胃中存在RCC古菌。Kim等[9]基于16S rRNA基因序列分析发现，这群古菌在系统进化关系上与热源体古菌相近，同时又存在较大差异。Janssen等[10]在全球数据组分析的基础上，将瘤胃内容物中检测到的92.3%瘤胃古菌分成三个属；其中，61.6%瘤胃古菌属于甲烷短杆菌（Methanobrevibacter），14.9%瘤胃古菌属于甲烷微菌（Methanomicrobium），15.8%的瘤胃古菌属于未培养古菌，这群未培养古菌被标记为瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC）。

2 RCC的分布

2.1 RCC在自然环境中的分布

RCC不仅存在于牛的瘤胃中，还广泛分布于其他动物的消化道、海洋、土壤等自然环境中。RCC最早在海洋环境中被发现[11]。随后，在水稻田土壤[12]、湖水[13]、垃圾填埋场渗滤液[14]、猪粪便[15]等环境中均发现RCC的存在。此外，许多研究发现，哺乳动物的消化道内亦存在RCC。Wright等[16]以美利奴羊为研究对象，发现其瘤胃中存在RCC古菌。Evans等[17]对尤金袋鼠前肠的甲烷菌群落组成进行研究，发现RCC古菌的存在。Jeyanathan等[18]研究发现，在绵羊、牛、马鹿的瘤胃中均存在RCC古菌群落。不仅在动物体内，研究还发现在人的龈袋和肠道中存在RCC古菌[19-22]。除了哺乳动物，在白蚁[23-25]、食木蟑螂[26]及圣甲虫幼虫[27]的肠道内均存在RCC古菌。综上所述，RCC古菌广泛分布于海洋、土壤、白蚁和哺乳动物的肠道等自然环境中。

2.2 RCC在瘤胃中的分布

到目前为止，RCC已在很多反刍动物瘤胃中被发现，其中包括牛[5-6，18，28-30]、绵羊[18，31-32]、山羊[33-34]、水牛[35]和马鹿[18]。虽然大量研究证明瘤胃产甲烷菌中的优势菌是Methanobrevibacter，但另一些研究发现，其他种属的产甲烷菌（例如：RCC）在瘤胃中也占有一定的比例。我们实验室通过454平台对摩拉和尼里-拉菲水牛瘤胃甲烷菌区系的研究表明，Methano⁃brevibacter是优势菌，而Thermoplasma属甲烷菌，即瘤胃古菌C簇（Rumen Cluster C,RCC），为第二优势菌。Jeyanathan等[18]以绵羊和牛为研究对象，结果显示RCC占总古菌数量的平均比例是26.5%。Janssen等[10]报道，RCC在瘤胃中的平均比例大约为15.8%。金巍[36]对山羊进行研究，结果显示高粗料组瘤胃内容物中RCC占总古菌数量的平均比例是26.7%，而高精料组的大幅度下降到3.1%。Pei等[28]对晋南牛进行研究，结果显示RCC占总甲烷菌的比例在瘤胃上皮黏膜中是25.5%，在瘤胃内容物液相中是12.4%，在瘤胃内容物固相中是23.7%。Chaudhary等[37]对印度摩拉水牛进行研究，发现其瘤胃内容物中RCC是第一优势菌。Huang等[32]对中国青藏高原奶牛和耗牛的研究，其结果亦显示其瘤胃中RCC最丰富。综上，RCC在反刍动物瘤胃中占有一定的比例，而且其在特定条件下会取代甲烷短杆菌成为瘤胃甲烷菌最优势菌群。因此，RCC是调控反刍动物甲烷产量的目标甲烷菌。

3 RCC的生物学特性

3.1 RCC的营养需求

产甲烷菌不能利用复杂的有机物，其主要能源和碳源物质有5种，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。根据底物类型，反刍动物瘤胃甲烷生成机制可分为四种：①氢营养型：利用氢气还原二氧化碳或利用甲酸生成甲烷；②乙酸盐营养型：裂解乙酸生成甲烷；③甲基营养型：利用甲醇、甲胺、二甲胺和三甲胺等甲基化合物生成甲烷；④氢+甲基营养类型：利用氢气还原甲醇或甲胺、二甲胺、三甲胺等甲基化合物生成甲烷[38]。

在反刍动物瘤胃中，氢营养甲烷菌是产甲烷菌群的优势菌[10]，其原因可能是它们具有相对快速的生长能力。快速的生长使氢营养甲烷菌能争夺到充足的底物，从而维持菌群规模。RCC极难分离纯化，目前尚未从瘤胃中成功分离出RCC的纯菌株。对其营养类型进行研究，有助于找到适合RCC的培养基，进而成功分离出RCC纯菌。金巍[36]利用体外共培养模型研究了鸡源RCC菌株MGC的氢营养特性。实验表明了MGC是严格利用氢气还原甲醇和三甲胺产生甲烷的产甲烷菌。Liu等[38]报道，RCC菌株MGC利用氢气还原甲基化合物生成甲烷。Fricke等[39]报道，RCC古菌利用氢气还原甲醇产生甲烷。在营养类型方面，甲烷微球菌严格利用氢气还原甲醇、甲胺、二甲胺和三甲胺产生甲烷[40]，RCC似乎与甲烷微球菌相同。此外，RCC不能利用二氧化碳，能以甲醇或三甲胺为底物生成甲烷。但是，仅在体外共培养模型中添加甲基化合物（甲醇或三甲胺）不能富集RCC菌株[36]。

3.2 宿主特异性和日粮对RCC的影响

RCC在瘤胃中的平均比例大约为15.8%[10]。在印度摩拉水牛[37]、中国青藏高原奶牛和耗牛[32]瘤胃中RCC是第一优势菌。然而，RCC在梅花鹿瘤胃的丰度不足1%[41]。此外，Jeyanathan 等[18]以羊、牛、马鹿为研究对象，发现饲喂相同日粮时RCC古菌群落结构在这三种动物之间存在差异。金巍[36]对山羊进行研究，结果显示精料组的RCC甲烷菌数量显著低于粗料组。这些研究认为，RCC的丰度和群落结构受宿主特异性和日粮因素影响。

4 基于DGGE技术和16S rRNA/rDNA技术的RCC研究进展

产甲烷古菌生存于严格厌氧的环境中，并且其生长速率通常很低，培养方式独特（需要Hungate滚管法厌氧培养或厌氧工作站），因此很难采用传统的分离培养技术对其进行研究。目前，尚未有分离得到RCC纯培养体的报道，即便得到了纯培养体，其形态和生理也可能产生很多变化。至今，反刍动物瘤胃中只有极小部分产甲烷菌得到分离。因此，现代分子生物学技术被广泛应用于瘤胃菌群的研究，其可有效地克服传统分析检测方法的缺点，更准确、更灵敏地反映出各种产甲烷菌的分子特性，并且基于基因序列分析的技术可发现瘤胃中可能存在的未知产甲烷菌。

变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Elec⁃trophoresis,DGGE)技术能够分离分子量相同而序列不同的DNA片段。DGGE技术1993年被Muyzer等[42]首次应用于分子微生物学领域研究。成艳芬[43]建立了适用于瘤胃古菌分析的DGGE方法。通过DGGE方法分析发现，山羊瘤胃中的主要产甲烷菌为甲烷短杆菌和RCC菌株LGM。Jeyanathan等[18]研究发现，RCC序列在全部古菌16s rRNA基因的DGGE图谱中不容易检测到，因为单一的序列类型不足以丰富到形成显带。瞬时温度梯度电泳（TTGE）是由DGGE改进而成。Nicholson等[7]运用TTGE技术对放牧羊和牛的瘤胃甲烷菌菌群多样性进行分析，结果证明它们瘤胃内存在大量RCC古菌。这些研究表明，DGGE技术对于瘤胃甲烷菌群多样性和未知生物群落的鉴定具有很好的效果。但技术也存在一些缺点，例如条带共迁移现象，图谱分辨率低，结果分析偏差，反映菌种多样性有限等等。这些缺点在一定程度上限制了该技术在瘤胃微生物系统上的应用。可以寻求一些方法来完善对菌群信息的揭秘。将DGGE技术与荧光原位杂交（FISH）、限制性片段长度多态性（RLFP）等多种生物技术一起应用，可以获取更完整的微生物信息。

16S rRNA/rDNA技术是根据不同微生物在16S rRNA及其基因（16S rDNA）可变区序列上的差异来进行微生物种类的分类和鉴定。近年来，随着生物技术的日臻成熟，计算机技术的普及，一些国际公认、公开的16S rDNA数据库的建立（如RDP、GenBank、SIL⁃VA、HOMD），古菌16S rRNA的资料不断得到完善，古菌的研究不断取得进展。Tajima等[5]通过16S rRNA的分子生物学方法分析牛瘤胃古菌的多样性，其研究首次报道了瘤胃中存在RCC古菌。Wright等[31]通过16S rRNA基因文库分析羊的瘤胃甲烷菌分子多样性，其研究首次验证了RCC古菌序列来源于瘤胃。同一作者进一步研究，Tymensen等[44]对牛的两种产甲烷菌群落结构进行16S rRNA序列分析和甲基辅酶M还原酶A(mcrA)基因克隆文库分析。结果表明，这两种产甲烷菌群落均是由甲烷短杆菌、甲烷微菌和RCC组成，其中RCC在独立生存产甲烷菌群落中更占优势。Paul等[45]对白蚁和蟑螂肠道的古菌进行16S rRNA基因分析和mcrA基因分析，结果表明它们肠道中存在一群与热源体相关的古菌，这群古菌实际上代表着产甲烷古菌的第七个目“Methanoplasmatales”（在瘤胃中被称为古菌C簇，简称RCC）。Jin等[46]利用16S rRNA基因克隆文库证明了RCC古菌存在于厌氧真菌培养物中。16S rRNA基因序列分析法具有特异性强、稳定性好、效率高、费用低等特点。因此，上述以16S rRNA基因为基础的分子生物学技术正日益成为微生物多样性研究的重要手段，但这些技术亦存在局限性和偏差，如数据库中部分序列数据不够准确，16S rRNA基因多拷贝和序列异质性的问题，生态理论模型发展不足,实验操作存在诸多影响因素等，对结果进行分析时要充分考虑这些因素。虽然基于16S rRNA的微生物多样性研究方法已经取得了巨大进展，但以16S rRNA为基础的分子生物学技术并不能完全替代其他的微生物生态技术。综合利用纯种分离、电镜镜检、生理生化指标检测、16S rRNA技术等方法，才能更客观而全面地反映微生物群落结构的真实信息，从而使我们对微生物群落有更深入的认识。

除了以上列举的技术，还有应用荧光定量PCR技术对瘤胃中RCC的分布进行研究的报道[46]。综上所述，由于RCC未能成功分离培养，因此当前许多相关研究是采用16S rRNA等不依赖培养的分子生物学技术和手段进行。这类方法虽然进一步推动了RCC的研究，但是这类方法不以获取RCC活体菌株为目的，导致我们无法准确了解RCC活菌的生命活动及其与瘤胃中其他微生物间相互作用的规律，进而无法精准调控反刍动物瘤胃发酵和减少甲烷排放。未来将分子生物学技术与传统培养方法相结合可能能更全面、真实地反映出RCC的各种生命活动。

5 总结

RCC是调控反刍动物甲烷产量的目标甲烷菌之一，研究RCC古菌对减少甲烷排放具有重要意义。由于RCC极难分离纯化，当前人们对其了解甚少。导致其难培养的原因有多种，可能是目前培养技术的限制，也可能是我们对其知之甚少，不了解其合适的生长繁殖条件。因此，RCC未来的研究方向可能是：深入探索它们的培养条件，逐步揭示其与其他瘤胃微生物间的关系，研究调控其甲烷生成过程的特定生物学机制。