人宫颈癌Hela细胞TPX2基因沉默对放射敏感性的影响

李美玲，张业玲，丁晓，雷炜，陆海军

(青岛大学附属医院，山东青岛 266071)

人宫颈癌Hela细胞TPX2基因沉默对放射敏感性的影响

李美玲，张业玲，丁晓，雷炜，陆海军

(青岛大学附属医院，山东青岛 266071)

目的 观察TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性。方法 将宫颈癌Hela细胞分为TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组，TPX2-siRNA组转染TPX2-siRNA，NC-siRNA组转染NC-siRNA即空载体siRNA，Control组仅加入转染试剂。采用实时荧光定量PCR、Western blot分别检测各组细胞中的TPX2 mRNA与蛋白。采用CCK8法检测不同剂量(0、2、4、6 Gy)X线照射后TPX2-siRNA组细胞的增殖抑制率。采用流式细胞术检测4 Gy X线照射前后TPX2-siRNA组细胞的凋亡率。结果 与NC-siRNA组、Control组相比，TPX2-siRNA组细胞TPX2 mRNA、蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。TPX2-siRNA组细胞接受0、2、4、6 Gy X线照射后，细胞增殖抑制率分别为4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%，两两组间比较P均<0.05。TPX2-siRNA组细胞接受4 Gy X线照射前后细胞凋亡率分别为11.43%±0.03%、12.68%±0.03%，两者比较P<0.05。结论 TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性增加。

TPX2基因；基因沉默；宫颈癌；放射敏感性

TPX2是一种编码基因定位于人12号染色体的微管相关蛋白，能激活细胞周期激酶Aurora A，并调节有丝分裂纺锤体的形成[1]。已有研究[2]发现，TPX2过表达于多种肿瘤细胞内，且与染色体的不稳定性密切相关。在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率逐年上升，目前放疗已经成为宫颈癌的主要治疗方法之一，但放疗敏感性的降低使宫颈癌的治疗出现瓶颈。已有研究[3]发现，TPX2基因在宫颈癌中存在过表达，并与宫颈癌的侵袭性、分期分级和淋巴结转移呈正相关。2015年1月～2016年1月，本研究应用小干扰技术，观察TPX2基因沉默后人宫颈癌Hela细胞的放射敏感性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 宫颈癌Hela细胞购于青岛大学附属医院中心实验室。RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Hyclone公司，逆转录、RT-PCR试剂盒、DNA Maker1000试剂购于美国TaKaRa公司，siRNA模板由广州锐博生物科技公司设计合成，riboFECTTMCP转染试剂购于广州锐博生物科技公司，TPX2抗体购于CST公司，GAPDH抗体购于康维试剂公司，real-time PCR所需引物的设计与合成由上海生工公司完成，CCK8试剂盒购于Sigma公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购于江苏碧云天生物试剂有限公司。细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)、PCR仪(FTC-3000上海枫岭)、流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养及分组 宫颈癌Hela细胞置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度中，在含10%胎牛血清、2%双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)的RPMI1640培养基中培养。将细胞分为TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组。

1.3 TPX2基因沉默方法 根据GenBank中TPX2的基因号(NM-012112)，针对靶基因TPX2由广州锐博生物科技公司设计siRNA，上游序列：5′-GAACUUUACAUCUGAACUA-3′，下游序列：3′-CUUGAAAUGUAGACUUGAU-5′。TPX2-siRNA组转染TPX2-siRNA，NC-siRNA组转染NC-siRNA即空载体siRNA，Control组仅加入转染试剂。转染前将(1～5)×105个处于对数生长期的Hela细胞均匀接种于适量完全培养基的24孔培养孔中，至细胞贴壁30%～50%时，用30 μL的1×riboFECTTMCP Buffer稀释1.25 μL 20 μmol/L siRNA储存液，加入3 μL的riboFECTTMCP Reagent，吹打摇匀后室温孵育30 min后将riboFECTTMCP混合液加入细胞培养基中混匀，将培养板放置于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h。

1.4 各组细胞TPX2 mRNA表达检测 采用RT-PCR。收集转染后的三组细胞,提取总RNA，按照反转录说明书制备cRNA，在FTC-3000PCR仪上进行扩增。TPX2上游引物为5′-TATGCCACCTGCAAAGCAGA-3′，下游引物为5′-ACAGGTTGCCCTATTCCAGC-3′。GAPDH上游引物为5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。反应条件为循环40次，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。以2-ΔΔCt法计算细胞TPX2 mRNA相对表达量。

1.5 各组细胞TPX2蛋白表达检测 采用Western blot法。收集转染后的三组细胞，提取细胞总蛋白后用BCA法测定蛋白浓度。制备15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量10 μL，120 mV恒定电压下电泳2 h后转膜1.5 h，取出转移膜，用50 g/L的脱脂牛奶封闭，兔抗人一抗(1∶5 000)、GAPDH一抗(1∶2 000)孵育过夜。PBST洗膜3遍，10 min/次，加入(1∶10 000)稀释的山羊抗兔辣根酶标记IgG(H+L)二抗，室温孵育1 h后PBST洗膜3次，10 min/次。用ECL发光液处理膜，暗室内曝光。TotalLab 2.0软件分析各组蛋白条带灰度值并计算TPX2蛋白相对表达量(目的基因条带灰度值/内参条带灰度值)。实验重复3次取平均值。

1.6 TPX2基因沉默Hela细胞的放射敏感性观察 利用VARIAN直线加速器，采用6 MV-X线，照射的剂量率为2 Gy/min，源皮距为100 cm，照射野为10 cm×10 cm，同时在培养板下置1 cm等效组织填充物，并控制机架角为180°。细胞在室温下接受照射。①CCK8法检测Hela细胞的增殖抑制率。将TPX2-siRNA组、Control组处于对数生长期的Hela细胞以6×103/孔分别接种于96孔中，转染后采用不同剂量(0、2、4、6 Gy)X线照射，每组设6个复孔，在37 ℃、5% CO2条件下继续培养24 h，每孔加10 μL CCK8溶液，继续培养2 h后，于分光光度计450 nm波长处测量OD值。根据OD值计算各组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值)/Control组OD值×100%。实验重复3次取平均值。②细胞凋亡检测。使用Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，根据其说明书进行操作。将TPX2-siRNA组处于对数生长的细胞接种于6孔板，转染后以4 Gy X线照射。培养24 h，胰酶消化，PBS洗涤后混悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，依次加入Annexin V-FICT和碘化丙啶(PI)试剂，室温，避光15 min后，即采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。用Flow Jo分析得到的数据，计算细胞凋亡率。实验重复3次取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞TPX2 mRNA相对表达量比较 TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组TPX2 mRNA相对表达量分别为0.47±0.01、0.81±0.01、1，TPX2-siRNA组与NC-siRNA组、Control组相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞TPX2蛋白相对表达量比较 TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组TPX2蛋白相对表达量分别为0.55±0.07、0.81±0.13、0.80±0.05，TPX2-siRNA组与NC-siRNA组、Control组相比，P均<0.05。

2.3 TPX2-siRNA组细胞对放疗的敏感性 TPX2-siRNA组细胞接受0、2、4、6 Gy X线照射后，细胞增殖抑制率分别为4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%，两两组间比较P均<0.05。TPX2-siRNA组细胞接受4 Gy X线照射前后细胞凋亡率分别为11.43%±0.03%、12.68%±0.03%，两者比较P<0.05。

3 讨论

宫颈癌是世界范围内位居第三位的肿瘤，且患病年龄呈现年轻化的趋势。高危型人乳头瘤病毒持续感染已被证实是宫颈癌发生的主要病因[4]。不断改进的根治性子宫切除术及辅助性放化疗可以提高早期宫颈癌患者的存活率，但在晚期宫颈癌疗效不明显。对于局部晚期宫颈癌，放疗成为其最主要的治疗手段之一，但是随着剂量的累积，肿瘤对于放射的敏感性逐渐下降，严重影响了放疗效果。

TPX2是一种细胞周期蛋白，在维持有丝分裂纺锤体的稳定性中起重要作用[5]。作为一种微管相关蛋白，在有丝分裂时，TPX2与纺锤体紧密结合。研究[6]证实，TPX2在许多肿瘤如唾液腺癌、肺癌、乳腺癌存过表达，并且其异常表达与中心体的扩增、异倍体的产生、肿瘤的形成与侵袭力有关。最近的研究[7]发现，TPX2在宫颈癌细胞中也存在过表达。此外，过表达的TPX2可阻止有丝分裂的正常进行，同时扰乱其自身信号通路的正常传导[8]。大量的实验表明，降低TPX2的水平可能对治疗肿瘤有益。通过RNA干扰技术，下调TPX2的表达能够使有丝分裂中微管的形成失败，从而导致纺锤体无法形成。比如TPX2下调可以有效降低肝细胞癌、胰腺癌细胞的增殖和存活能力[9,10]。有研究[11]认为过度表达的TPX2降低了电离辐射诱导γ-H2AX增加的作用，其中γ-H2AX可以作为衡量DNA损伤的指示器。有研究者认为，γ-H2AX在电离辐射后存在一个形成与消失的过程，其存在的时间长短与肿瘤放疗敏感性之间存在相关关系[12]。Gernot等[11]发现，细胞内的TPX2耗损后，应用电离辐射可导致γ-H2AX的短暂增加。本研究通过RNA干扰技术对Hela细胞中TPX2基因的表达进行干预，以观察沉默TPX2的Hela细胞的放射敏感性。研究结果表明，沉默TPX2基因的Hela细胞在接受射线照射时，随着剂量的增加，各组细胞增殖抑制率逐渐增加。且TPX2-siRNA组接受照射后细胞凋亡率增加。这些说明了沉默TPX2基因的Hela细胞对射线的敏感性增加。

本研究存在一些缺陷，siRNA转染细胞后发挥作用存在一定的时效性，其不稳定性决定了实验的局限性；并且在进行细胞对射线的敏感性观察中，缺少对肿瘤细胞生物学行为改变的研究。

[1] Kufer TA， Silljé HH， Körner R， et al. Human TPX2 is required for targeting Aurora-A kinase to the spindle[J]. J Cell Bio, 2002,158(4):617-623.

[2] Carter SL, Eklund AC, Kohane IS, et al. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers[J]. Nat Genet, 2006,38(9):1043-1048.

[3] Chang H, Wang J, Tian Y, et al. The TPX2 gene is a promising diagnostic and therapeutic target for cervical cancer[J]. Oncol Rep, 2012,27(5):1353-1359.

[4] Wei P, Zhang N, Xu Y, et al. TPX2 is a novel prognostic marker for the growth and metastasis of colon cancer[J]. J Transl Med, 2013,17(11):313.

[5] Chang H, Wang J, Tian Y, et al. The TPX2 gene is a promising diagnostic and therapeutic target for cervical cancer[J]. Onco Rep, 2012,27(5):1353-1359.

[6] 王楠,马蓉，吴建中，等.宫颈癌的发病机制、诊断及治疗进展[J].中国肿瘤外科杂志,2013,4(5):121-122.

[7] Gernot N, Camille B, Oliver J, et al. TPX2: of spindle assembly, DNA damage response, and cancer[J]. Cell Mol Life Sci, 2014,71(16):3027-3047

[8] Aguirre AJ, Brennan C, Bailey G, et al. Highresolutioncharacterization of the pancreatic adenocarcinomagenome[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(24):9067-9072.

[9] Satow R, Shitashige M, Kanai Y, et al. Combined functional genome survey of therapeutic targets for hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2010,16(9):2518-2528.

[10] Kurz EU, Lees-Miller SP. DNA damage-induced activation of ATM and ATM-dependent signaling pathways[J]. DNA Repair, 2004,3(8-9):889-900.

[11] 曹明丽，陈可欣.组蛋白H2AX磷酸化与肿瘤放疗敏感性关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(9):715-718.

[12] Gernot N, Angela H, Su YS, et al. Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2(TPX2) Regulates γ-Histone 2AX (γ-H2AX) Levels upon lonizing Radiation[J]. J Biol Chem, 2012,287(50):42206-42222.

陆海军(E-mail： lhj82920608@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.015

R730.55

A

1002-266X(2017)02-0047-03

2016-09-16)