miR-363、Eomes在人脐带间充质干细胞诱导神经样细胞中的表达及意义

赵晓彬,杨子微,高振宇

(1辽宁省消防总队医院，沈阳 110032；2锦州市中心医院)

miR-363、Eomes在人脐带间充质干细胞诱导神经样细胞中的表达及意义

赵晓彬1,杨子微2,高振宇2

(1辽宁省消防总队医院，沈阳 110032；2锦州市中心医院)

目的 观察miR-363、脱中胚蛋白(Eomes)在人脐带间充质干细胞(HUMSCs)诱导的神经样细胞中的表达变化，并探讨其意义。方法 培养HUMSCs并应用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、视黄酸、丁基羟基茴香醚联合诱导分化为神经样细胞，采用免疫荧光化学法检测诱导前后细胞β-Ⅲ-tubulin和NSE的表达；real-time PCR检测诱导前后细胞中miR-363和Eomes mRNA的表达，Western blot检测诱导前后细胞中Eomes蛋白的表达；运用生物信息学方法(TargetScan和miRanda)对miR-363和Eomes基因的靶向配对关系进行预测，采用荧光素酶报告系统进行鉴定。结果 光镜下可见HUMSCs呈梭形均匀分布，诱导分化后细胞呈圆形、有长的突起；免疫荧光检测发现诱导14 d的细胞β-Ⅲ-tubulin和NSE表达呈阳性，神经样细胞诱导成功。HUMSCs诱导分化前后miR-363相对表达量分别为1.00±0.31、0.32±0.02，Eomes mRNA相对表达量分别为1.00±0.22、15.73±0.85，Eomes蛋白相对表达量分别为0.21±0.02、0.78±0.06，两者比较，P均<0.05。生物信息学软件结果显示miR-363和Eomes基因靶向配对良好，荧光素酶报告系统鉴定发现miR-363能够抑制Eomes mRNA表达。结论 miR-363能够靶向作用Eomes 3′UTR负性调控HUMSCs神经样细胞分化后Eomes的表达。

微小RNA-363；脱中胚蛋白；人脐带间充质干细胞；神经样细胞

脱中胚蛋白(Eomes)是神经发育中后期表达的重要转录因子，在神经祖细胞中高表达[5]，推测其可在神经的诱导分化过程中起重要作用。miRNA是一类小的非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)互补，调节靶基因的表达[6]，以此参与个体发育、细胞分化以及疾病发生过程中基因表达的调控。本研究应用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、视黄酸(RA)、丁基羟基茴香醚(BHA)联合诱导HUMSCs向神经样细胞分化，观察细胞分化后miR-363、Eomes表达情况，并探讨两者的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 HUMSCs由锦州市中心医院保存。反转录试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、RNAiso for small RNA和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司，定点突变试剂盒购自Stratagene公司，pmirGLO质粒和Dual-Luciferase®报告系统购自Promega公司，脂质体2000购自Invitrogen公司，miR-363模拟物购自GenePharma公司，siRNA购自Dharmacon公司，IBMX、RA和BHA购自Sigma公司，兔抗人微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体购自Santa Cruz公司，293T细胞购自上海生物细胞研究所。

1.2 HUMSCs神经样细胞的诱导分化及鉴定 取HUMSCs接种到25 cm2培养瓶内，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每3～4 d换液1次，待细胞达到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化并传代。HUMSCs传至3～4代，细胞均匀分布，形态规则均一，呈梭形。取第三代细胞做诱导分化，培养基中加入0.1 mmol/L IBMX、0.5 μmol/L RA和200 μmol/L BHA。HUMSCs诱导分化后可见细胞呈圆形，有长的突起。取诱导培养14 d的细胞，PBS冲洗，10%甲醛固定后，0.1% BSA封闭1 h。分别加兔抗人β-Ⅲ-tubulin抗体(1∶300)以及NSE抗体(1∶200)，4 ℃过夜，PBS浸洗3次，每次5 min。二抗加FITC标记山羊抗兔IgG抗体(1∶500)，DAPI复染细胞核。免疫荧光检测结果发现，细胞中β-Ⅲ-tubulin和NSE两种标志物均阳性表达，显示绿色荧光，神经样细胞诱导成功。

1.3 细胞中miR-363、Eomes mRNA检测 采用real-time PCR。取诱导成功的神经样细胞(诱导组)和HUMSCs(对照组)，分别加入TRIzol或RNAiso for small RNA提取总mRNA或总miRNA，运用反转录试剂盒反转录为cDNA，稀释后加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和引物。序列如下：Eomes正向引物为5′-CAAGGTTCTGTATTTATTT-3′，反向引物为5′-TTTAACTCATCTGATAGC-3′；GAPDH正向引物为5′-CCCCTTCATTGACCTCAACT-3′，反向引物为5′-ATGAGTCCTTCCACGATACC-3′；miR-363正向引物为5′AATTGCACGGTATCCATCTGTA-3′(通用引物试剂盒自带)；U6正向引物为5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物为5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反应条件为94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt法对反应结果进行定量分析。

1.4 细胞中Eomes蛋白表达检测 采用Western blot法。取上述两组细胞，分别加入RIPA裂解液充分震荡后，超声破碎，4 ℃离心20 min，采用BCA法测定样品总蛋白量。取15 μL样品SDS-PAGE分离后转膜，应用4% BSA封闭1 h，加入兔抗人Eomes抗体(1∶200)，4 ℃过夜后，滴加二抗(1∶800)，4 ℃摇床1 h后凝胶成像系统ECL发光显影。条带经扫描后用图像分析系统进行半定量分析，根据积分吸光度值对比分析条带的强弱，β-actin作为内参，Eomes/β-actin代表Eomes的相对表达量。

1.5 细胞中miR-363与Eomes的关系验证 运用miRNA生物信息学软件TargetScan和miRanda对miR-363和Eomes基因(NM_005442)的靶向匹配关系进行预测。取诱导成功的神经样细胞，运用正向引物5′-CCGAGCTCATTGTCACCAGCATA-3′和反向引物5′-GCTCTAGAAGCCAGCCAGTATTA-3′扩增Eomes mRNA 3′UTR，定点突变试剂盒构建Eomes 3′UTR突变体(3′UTRmu)。Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切Eomes 3′UTR、3′UTRmu以及pmirGLO质粒，构建荧光素酶报告载体(3′UTR-pmirGLO和3′UTRmu-pmirGLO)，转化入感受态细胞中扩增。脂质体2000转染Eomes 3′UTR-pmirGLO或3′UTRmu-pmirGLO以及miR-363模拟物或对照miRNA进入293T细胞，将对照miRNA的Eomes 3′UTR-pmirGLO荧光素酶表达量设为1，Dual-Luciferase®报告系统检测荧光强度。

2 结果

2.1 两组细胞miR-363、Eomes mRNA表达比较 诱导组、对照组miR-363相对表达量分别为0.32±0.02、1.00±0.31，Eomes mRNA相对表达量分别为15.73±0.85、1.00±0.22，两组比较，P均<0.05。

2.2 两组细胞Eomes蛋白表达比较 诱导组、对照组Eomes蛋白相对表达量分别为0.78±0.06、0.21±0.02，两组比较，P<0.05。

2.3 细胞中miR-363与Eomes的关系 TargetScan显示miR-363在Eomes mRNA的3′UTR上有一个脊椎动物间保守的靶位点，靶位点类型为7mer-m8，“context+score”百分数为95，其与靶位点互补情况良好。miRanda显示miR-363与靶位点匹配的mirSVR得分为-1.135 0，表明miR-363与3′UTR结合情况良好。荧光素酶报告系统检测结果显示，miR-363能使3′UTR-pmirGLO的荧光素酶表达量下降为0.40±0.06，对照miRNA的3′UTRmu-pmirGLO荧光素酶表达量为1.06±0.02，转染miR-363模拟物后其表达量为1.01±0.05，miR-363能够靶向抑制Eomes mRNA表达。

3 讨论

研究发现，HUMSCs诱导后能够向神经细胞分化。Fu等[7]诱导HUMSCs发生神经细胞样形态学改变，并能够检测到谷氨酸脱羧酶的表达，细胞受到谷氨酸刺激后能够产生内向电流，表明细胞具备成熟神经元的某些特性。Ma等[8]应用丹参和β-巯基乙醇诱导HUMSCs，发现细胞出现典型的神经性形态学改变，并表达巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和β-Ⅲ-tubulin。Ding等[9]应用β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和脑源性神经营养因子诱导HUMSCs，发现诱导后的细胞能够表达神经标志物GFAP和微管相关蛋白。本研究成功实现HUMSCs向神经样细胞的诱导分化。

Eomes是神经发育中后期表达的重要转录因子，在神经祖细胞中高表达，推测其可在神经的诱导分化过程中起重要作用。因此，本研究选取Eomes作为目标蛋白，real-time PCR和Western blot检测诱导后的神经样细胞发现有Eomes的高表达，表明Eomes作为重要的神经转录因子参与了神经细胞的分化过程，提示其可作为神经样细胞诱导分化的标志物之一。

miRNAs作为一类小的内源性非编码RNA已被证实广泛参与生命活动过程中基因表达的调控，Duan等[10]研究发现，应用DMSO和BHA能够将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞，诱导后有NSE和Tau的高表达，而REST表达降低。应用基因芯片筛选发现诱导后有14种miRNAs的高表达，进一步应用双荧光素酶报告系统发现miR-29a能够靶向作用于REST 3′UTR抑制其表达。Zhuang等[11]将HUMSCs诱导分化为神经样细胞，应用基因芯片筛选发现诱导前后有6种miRNAs表达差异明显，miR-1290、miR-26b、miR-194和miR-124a高表达，而miR-4521、miR-543低表达，表明miRNAs参与了神经样细胞的诱导分化过程。本研究检测结果显示，诱导组细胞miR-363表达降低，Eomes mRNA、蛋白表达升高，生物信息学方法发现miR-363与Eomes 3′UTR结合情况良好，miR-363能够靶向抑制Eomes mRNA表达。可见随着诱导分化时间的延长，Eomes蛋白表达逐渐增多，表明Eomes对细胞的诱导分化有积极意义，Eomes蛋白的高表达抑制了内源性miR-363的表达，miR-363能够靶向作用Eomes 3′UTR负性调控HUMSCs神经样细胞分化后Eomes的表达。

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(收稿日期：2016-09-26)

赵晓彬(E-mail: lywangxueqin@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.013

R342.22

A

1002-266X(2017)02-0042-03

2016-09-20)

受损脊髓的再生在脊髓损伤的治疗中前景广阔，

人脐带间充质干细胞(HUMSCs)以取材容易和免疫原性低被广泛作为组织工程的种子细胞[1,2]，可被诱导分化为神经样细胞用于脊髓损伤的再生治疗[3,4]。