禽流感与鸡新城疫的血凝和血凝抑制试验操作要点及注意事项

董长远 栾伟丽 （山东省淄博市张店区动物疫病预防控制中心 255000）

禽流感与鸡新城疫的血凝和血凝抑制试验操作要点及注意事项

董长远 栾伟丽 （山东省淄博市张店区动物疫病预防控制中心 255000）

血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验是科学评估和分析禽流感与鸡新城疫疫病流行状况及免疫效果的一个重要手段和方法。虽然方法简单，但如果操作不规范极易导致试验结果偏差，本文着重对禽流感与鸡新城疫的HA和HI试验的操作要点及注意事项进行阐述和分析，对正确掌握试验方法，提高试验准确性，避免或减少试验误差具有重要的指导意义。

血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验是禽流感与鸡新城疫疫病监测和免疫抗体检测中最常用的一种血清学监测方法，因所需仪器设备少，操作简单，一般兽医实验室都具备开展该项工作的条件。虽然HA、HI试验要求条件不高，但如果实验室人员操作不规范、使用标准不准确，试验耗材和试验环境条件达不到要求，检测结果也会出现偏离现象。

1 操作要点

1.1 1%红细胞制备 HA与HI试验前需要先制备1%红细胞悬液。由于不同个体鸡只红细胞对病毒的敏感性不同从而影响HI效价，所以一般需要采取3只以上无禽流感和新城疫等抗体的健康成年公鸡血液，在洗涤红细胞的过程中，每次离心后，须用吸管吸去上清液和白细胞层。若是采用免疫过的公鸡需要充分洗去血清,可洗涤5～6次。红细胞的洗涤程度应保证上清液呈清澈透明状为准。红细胞经过反复离心洗涤后用PBS液配成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2 HA效价判定 病毒抗原效价在血凝抑制试验中至关重要，所以每次试验前必须对抗原效价进行测定。抗原效价测定不准确对试验结果有一定影响。在PBS对照孔出现正确结果的情况下(红细胞完全沉淀)，将反应板倾斜(不大于60°)观察红细胞是否完全凝集，以能使红细胞完全凝集(不流淌)的抗原最高稀释倍数，作为抗原的凝集效价，即按这个比例稀释的抗原就是1单位的血凝抗原(HAU)。为了测出准确的抗原效价，建议试验中同时进行3～4排测定，取抗原效价值中一致性大的作为本次试验的HA效价。举例说明，如果3排病毒抗原的HA效价分别为1：512、1：512和1：256，则此次HA试验的HA效价可判为1：512。HA试验判定时间以红细胞对照孔完全沉淀为标准，一般在室温条件下30～40min出结果。

1.3 4单位抗原(4HAU)配制与回归试验 血凝滴度除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。4HAU抗原要现用现配，配好的4HAU抗原应在2h内用完。为了保证4单位抗原的准确，建议4单位抗原配好后进行回归试验。具体做法是如下：在微量反应板的1～4排的1～4孔内各加入0.025ml PBS液。取已配好的4HAu抗原混匀液0.025ml加入反应板的第1孔内，混匀后吸取0.025ml加入第2孔，依次倍比稀释至第4孔，从第4孔内吸取0.025ml弃掉。每孔内加入0.025ml l%红细胞悬混液，振荡混匀，20～25℃静置20min后观察结果。若l孔、2孔红细胞完全凝集，而3孔、4孔不凝集，则说明4个HAU配制准确。如果前3孔完全凝集，说明所配4HAU抗原实际是8个血凝单位，需等量稀释病毒抗原，如果只有前1孔完全凝集，说明所配4HAU抗原实际是2个血凝单位，病毒抗原量需加倍。如果所配抗原浓度过低，则所测定的血清抗体效价偏高；如果抗原浓度过高，则所测定的血清抗体效价偏低。

1.4 HI结果判定 每次HI试验必须设定阳性血清对照和阴性血清对照，以保证试验条件成立。同时，抗原对照孔必须完全凝集，稀释液对照孔必须完全沉淀。否则试验不成立。在对照完全正确情况下，将反应板倾斜(不大于60°)，从背面观察红细胞是否呈现泪滴状流淌，可参考稀释液对照孔进行比对，与稀释液对照孔泪滴长度相同的孔判为HI效价。泪滴长度会随时间变化，所以判断时应迅速。HI判定时间，以抗原对照孔出现完全凝集，稀释液对照孔出现完全沉淀为标准。一般在室温条件下30～40min出结果。

2 注意的问题

2.1 禽流感与鸡新城疫执行标准不同 在HA、HI试验中，虽然禽流感与鸡新城疫的血凝和血凝抑制试验原理相同、操作方法相同，但执行标准不相同。禽流感执行《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003)，鸡新城疫执行《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)。这两个诊断技术中，1%鸡红细胞悬液制备和PBS液配制方法均不同，试验中不能混用。

2.2 反应板的选择 应使用90°有机血凝板，勿使用110°有机血凝板。使用有机血凝板，在试验结束后要按程序清洗干净。目前，实验室多使用一次性优质V型塑料反应板，使用后不用清洗。试验中，要避免因反应板质量问题而造成试验结果偏离。

2.3 稀释液的选择 生理盐水和磷酸盐缓冲液是实验室最为常用的两种稀释溶液。在HA和HI试验中，为减少稀释液对试验结果的影响，选择对酸碱具有一定缓冲能力的PBS液要比生理盐水的试验效果好。建议检测时使用符合标准要求的pH7.2、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS液)，不要因怕配制PBS液麻烦而使用生理盐水代替。

2.4 血清的处理 （1）冷冻血清处理：冻结血清融化后，会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象。在检测前应充分混匀，混匀时切记剧烈振荡，可采用上下颠倒几次的方式混匀。（2）水禽血清处理：除鸡外，有些禽的血清可能对鸡红细胞产生非特异性的凝集。用鸡红细胞检测水禽血清时，需要除去存在于血清中的非特异凝集素。方法是在每0.5ml的血清中加入0.025ml的鸡红细胞轻摇后静置至少30min，800r/min离心2～5min，收集上清液即为处理后的血清。亦可用被检禽种的红细胞。

2.5 抗原和1%红细胞悬液的保存 抗原开封溶解后，置-15～-18℃冷冻保存，反复冻融应不超过20次，若2～8℃保存应不超过3个月。若当天试验任务未完成，可将病毒抗原冷冻或冷藏保存。第2天继续开展试验时，需要重新测定禽流感病毒抗原HA效价。1%红细胞悬液在4℃条件下可保存5d左右。试验开始前，将配好的红细胞悬液混匀，根据当日或本次检测任务量，将本次检测所需红细胞悬液倒入烧杯或锥形瓶留用，剩余红细胞悬液继续4℃条件保存备用。

2.6 移液器使用和加样操作中注意事项 （1）取样时，移液器只需按到第1档停点，排样时需按到第2档停点，才能彻底排出，以达到准确的取样量。（2）吸取液体时要缓慢平稳地松开拇指，切记不能过快。同时，将吸头沿器壁滑出容器，以除去吸头外多余的液体。（3）加样时注意吸头勿碰触到V板孔，以免发生交叉污染。（4）倍比稀释时，拇指要慢按、慢松移液器按钮，以避免产生过多的泡沫，引起移液量不准，混合不均，从而影响检测结果的准确性。（5）红细胞悬液和病毒悬液在使用前要摇匀，红细胞悬液更应随用随摇，保证每一孔中加入的红细胞悬液和病毒悬液浓度一致。否则，加入时浓度高低不一，会造成人为误差。（6）实际检测工作中，有时需要在一定时间内对一批血清进行禽流感几种毒株或亚型的检测，如同时测定H5亚型Re-6、Re-8株、H7亚型抗体水平，为避免几种抗原液混淆，必须在盛放抗原液的加样槽上作标记。由于一次试验需用多块反应板，反应板也应编号区别。

2.7 环境温度和孵育时间的控制 《高致病性禽流感诊断技术》和《新城疫诊断技术》中要求HA和HI试验的环境温度控制在20～25℃。在环境温度20～25℃时，经过30～40min即可读出抗原滴度和血清抗体效价。HI试验的反应时间与试验环境温度成正比，即环境温度升高所需反应时间缩短。当温度过低如低于15℃时，出现结果就会变慢，往往需要超过40min才能判定结果。HI判定时间，以抗原对照孔出现完全凝集，稀释液对照孔完全沉淀为标准。一般在室温条件下30～40min出结果。一块反应板从开始加样到判定结果大致需要70min，当环境温度不在20～25℃范围内，用空调进行室温调节时，为防止反应板内液体蒸发，应避免在空调排风口下操作，也可在加完样后用A4复印纸盖住反应板。

3 小结

禽流感与鸡新城疫HA和HI试验影响因素甚多，结果准确与否，与试验中各个影响要素的综合作用密切相关。试验中应严格控制试验条件，准确控制红细胞悬液和抗原工作浓度，同时严格控制试验温度和作用时间，尽可能把各种影响降至最低。特别是要规范操作，努力减少人为因素的影响。另外，要确保HA与HI试验结果的准确性，还需要在试验实践的基础反复练习才能达到预期的目的。

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1007-1733(2017)12-0053-02

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