环状RNAs在消化系恶性肿瘤中的表达、生物学功能及临床应用研究进展

何存存，吴会超，成绍敏

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

环状RNAs在消化系恶性肿瘤中的表达、生物学功能及临床应用研究进展

何存存，吴会超，成绍敏

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

环状RNAs高度稳定，且不易被核酸外切酶降解，能够存在于外泌体和血液中。其在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌中表达异常，具有微小RNA海绵、参与蛋白翻译、调控基因转录及剪切等功能，通过多种信号通路在上述消化系肿瘤发生、发展及转移中发挥重要调控作用，并且可以作为分子标志物用于消化道肿瘤的诊断和预后判断。

环状RNA；食管鳞癌；胃癌；结直肠癌；肝细胞癌；胰腺导管癌；微小RNA

环状RNAs是非编码RNAs(ncRNAs)家族中的一类竞争性内源性RNAs(ceRNAs)[1]，其分子结构呈闭合环状，以共价键结合，不含有5′-帽和3′-多聚腺苷酸A尾结构，因此对核糖核酸酶不敏感，比线状RNA更加稳定，且不易被降解[2]。环状RNAs与人类疾病息息相关，估计约15%的活性基因会产生环状RNAs[3]。新近的研究证实，环状RNAs在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌中表达异常，与细胞间黏附、细胞周期调节以及肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关[4]。本文就环状RNAs在消化系恶性肿瘤中的表达、生物学功能及临床应用研究进展作一综述。

1 环状RNAs在消化系恶性肿瘤中的表达

环状RNAs在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌等消化系恶性肿瘤中均有表达异常，并与肿瘤分期、浸润深度及淋巴结转移等临床病理参数相关。

1.1 环状RNAs在食管鳞癌中的表达 有研究表明，环状RNA cir-ITCH在食管鳞癌组织中呈低表达，作为miR-7、miR-17和miR-214的海绵，cir-ITCH可以增加其亲本基因ITCH的表达水平，促进磷酸化Dvl2的泛素化和降解，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而对食管鳞癌产生抑制作用[5]。Xia等[6]通过对51例食管鳞癌患者的研究发现，与癌旁组织相比，环状RNA hsa-circ-0067934在食管鳞癌组织中显著过表达，且其高表达程度与食管鳞癌分化程度、TNM分期等有关。通过siRNA体外沉默，hsa-circ-0067934能够抑制食管鳞癌细胞的增殖迁移和阻遏细胞周期进展，这表明hsa-circ-0067934有望成为食管鳞癌的一种新型的诊断标志物和靶向治疗目标。

1.2 环状RNAs在胃癌中的表达 Pan等[7]检测了102例原发胃癌组织及其配对的癌旁组织中的环状RNA-7(ciRS-7)，结果显示ciRS-7在胃癌组织中的表达显著上调，其过表达与胃癌的肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移相关，提示其可作为胃癌预后不良的一个独立危险因素。通过进一步的细胞实验证实，ciRS-7过表达可激活PTEN/PI3K/AKT信号通路来抑制微小RNA-7(miR-7)功能，从而影响miR-7在胃癌中的肿瘤抑制作用。当然也有学者通过对基因组位点扩增的研究发现，环状RNA circ-PVT1在胃癌组织中表达上调，且其作为miR-125家族成员的海绵，能够促进胃癌细胞增殖[8]。环状RNA Has-circ-0000190首次被发现在胃癌组织和血浆中表达下调，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和CA19-9水平显著相关[9]。

1.3 环状RNAs在结直肠癌中的表达 Dou等[10]对来源于同一结直肠癌细胞株的三种细胞DLD-1(既含KRAS野生型又含KRAS突变型)、DKO-1(只含KRAS突变型)和DKs-8(只含KRAS野生型)进行检测，发现与DKs-8细胞株相比，环状RNAs在DLD-1和DKO-1细胞株中显著下调，大部分环状RNAs在KRAS突变的结直肠癌细胞中表达下调，表明了KRAS基因突变对环状RNAs的表达产生广泛影响。此外，在这三个细胞株分泌的相应的细胞外囊泡(EVs)中也检测到了环状RNAs，且外泌体中环状RNAs表达比细胞内丰富。Weng等[11]研究显示，ciRS-7在结直肠癌组织中显著上调，其过度表达与结直肠癌患者转移和不良预后相关。进一步通过细胞实验表明，ciRS-7在HCT116和HT29细胞中过表达可阻碍miR-7的肿瘤抑制作用，激活其靶基因，促进结直肠癌细胞增殖、侵袭及转移。

1.4 环状RNAs在肝细胞癌中的表达 Xu等[12]研究发现，ciRS-7与miR-7在肝癌组织中的表达呈负相关，而与miR-7的靶基因磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(PIK3CD)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达呈正相关，ciRS-7可通过抑制肝癌中miR-7表达，间接抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而促进肝癌微血管浸润(MVI)。肝细胞癌组织中ciRS-7表达与患者年龄、甲胎蛋白水平、肿瘤直径、肿瘤包膜、MVI程度和不良预后显著相关，提示ciRS-7可能参与肝细胞癌的发生发展，能够作为肝细胞癌预后判断的生物标志物和微血管浸润的靶向治疗目标。一项针对肝细胞癌的遗传学和流行病学的研究发现，cir-ITCH在肝细胞癌组织中的表达显著低于配对的癌旁组织，COX回归分析提示cir-ITCH表达相对较高的肝细胞癌患者有着相对良好的预后，揭示了cir-ITCH可能对肝细胞癌有抑制作用，可作为肝细胞癌患者易感性和预后评估的生物标志物[13]。由此可知，环状RNAs在肝细胞癌中的表达与一些传统的生物标志物如甲胎蛋白和miRNAs有关，它们可能与miRNAs相互作用，充当miRNA海绵，调控miRNA靶基因的表达，影响肝癌的发生发展。此外，与miRNAs相比，环状RNAs更稳定，甚至可以在外泌体中检测到。因此，我们认为环状RNAs和传统的生物标志物的联合应用可为肝细胞癌的诊断提供更好的理论依据。

1.5 环状RNAs在胰腺导管腺癌中的表达 Li等[14]使用基因芯片对胰腺导管腺癌中环状RNAs表达谱进行研究，并使用微阵列分析发现，共有351种环状RNAs在胰腺导管腺癌组织及其配对的正常组织之间存在表达差异，其中在肿瘤组织中有209种环状RNAs表达上调，142种环状RNAs表达下调。后来对随机选取的7种有表达差异的环状RNAs进行验证，包括有2种表达上调的(hsa-circ-0001946、hsa-circ-0005397)和5种表达下调的(hsa-circ-0006913、hsa-circ-0000257、hsa-circ-0005785、hsa-circ-0041150和hsa-circ-0008719)，结果发现上述环状RNAs表达模式与基因芯片数据一致。在这些环状RNAs中，hsa-circ-0005785有可能作为微小RNA海绵抑制miR181a和miR181b，而miR-181a在胰腺癌生长和转移过程中发挥至关重要的作用[15]，miR-181b的表达与胰腺癌细胞对吉西他滨耐药密切相关[16]。

2 环状RNAs的生物学功能

2.1 作为竞争性内源性RNAs或微小RNA海绵 Hansen等[3]的研究发现，一些环状RNAs的RNA结合蛋白(RBP)丰富，可充当微小RNA海绵，通过自身含有的微小RNA(miRNA)结合位点，与miRNA竞争性结合mRNA 3′非翻译区(3′UTR)的miRNA识别元件(MRE)，降低miRNA对其靶基因的抑制或降解作用，从而增加其靶基因的mRNA及蛋白的表达水平，参与肿瘤发生发展过程中重要的生物学调控[17]。其中ciRS-7也被称为小脑变性相关蛋白1反义转录物，它拥有至少70个miR-7的选择性保守结合位点，充当miR-7海绵，有效调控miR-7，从而降低miR-7对其靶基因的抑制作用[18]。CiRS-7过表达可间接增加miR-7靶基因下游的表皮生长因子受体(EGFR)表达，进而调控细胞的生长、增殖、分化和肿瘤细胞的信号转导[11]。同样地，另一个作为微小RNA海绵的circRNA是cir-ITCH，它跨越了E3泛素化蛋白连接酶的几个外显子，由亲本基因ITCH衍生而来，含有miR-7、miR-17 和miR-214的结合位点[19]。除此之外，雄性性别决定基因含有miR-138的保守结合位点[3]。总之，环状RNAs作为竞争性内源性RNAs或微小RNA海绵的功能目前已经得到证实，但其在肿瘤发生发展中的具体生物学机制及能否通过干预此途径来提高肿瘤分子靶向治疗仍有待进一步研究。

2.2 参与蛋白翻译 起初认为，环状RNAs不含有5′- 帽和3′- 多聚腺苷酸A尾结构，且大多数存在于细胞质中，缺乏相应的内部核糖体进入位点(IRES)，不能翻译出蛋白质[20]。但后来有研究报道，一部分内源性环状RNAs能够被翻译成蛋白质[21]。一些研究表明，在起始密码子上游含有IRES序列的人工环状RNAs能翻译出功能性的绿色荧光蛋白(GFP)[20]。Legnini等[22]发现，环状RNA circ-ZNF609在小鼠成肌细胞中可被IRES驱动，转化为蛋白质。Pamudurti等[23]对飞行昆虫头部提取物的质谱分析发现，环状RNA circMbl3也能够翻译出蛋白质。一些具有多个标记编码序列的人工合成环状RNAs在没有任何特定的IRES驱动的情况下，可通过类似于滚环扩增(RCA)的机制，也能够翻译蛋白质[21]。

2.3 调控基因转录及剪切 环状RNAs还可以调控基因转录，其机制多种多样，比如以通过miRNAs发挥作用。这一部分环状RNAs基本存在于原核生物。例如环状RNAs circ-EIF3J和circ-PAIP2可以通过与U1核小核糖蛋白体和RNA聚合酶Ⅱ相互作用，增强HeLa细胞和HEK293细胞中亲本基因的表达[24]。也有研究发现，环状RNAs ci-ankrd52和ci-sirt7也能够通过与RNA聚合酶Ⅱ相互作用在其亲本基因中起到正反馈调控功能[25]。这表明环状RNAs也能调控亲本基因转录。Ashwal-Fluss等[26]发现环状RNAs可以通过竞争剪接因子调控亲本基因表达。以上研究表明，circRNAs在亲本基因的不同表达水平即可起到正反馈调控，又可起到负反馈调控。

2.4 调控肿瘤信号通路 环状RNAs通过多种机制参与肿瘤分子生物学调控，其中最重要的为ciRS-7/miR-7调控轴。越来越多的证据显示，miR-7在肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、舌癌及神经鞘肿瘤等多种肿瘤中作为抑制基因参与癌症发生。Chou等[27]研究发现，在肺癌中ciRS-7能增加miR-7靶基因的表达，显著降低肿瘤抑制基因miR-7的活性。而miR-7参与多种肿瘤信号通路，如miR-7可直接下调EGFR、mTOR、PIK3CD、胰岛素受体底物1(IRS-1)及黏着斑激酶(FAK)等。在体外，miR-7过表达通过调控PI3K/Akt信号通路参与细胞周期阻滞和细胞迁移。已经有相关研究证实，肿瘤干细胞(CSCs)在癌症进展和转移中起重要作用，miR-7在CSCs中表达下调。Kruppel样因子4(KLF4)作为CSCs中关键的转录因子，miR-7抗癌作用的部分原因可能是它能够抑制KLF4，这一调节在乳腺癌转移中起着重要作用[28]。此外，miR-7通过下调组蛋白赖氨酸1(SETDB1)来间接调控信号转导与转录激活因子3(STAT3)，导致EMT并抑制乳腺癌干细胞细胞侵袭转移[29]。在胃癌发生发展过程中，miR-7通过抑制IGF1R，上调E钙黏蛋白，从而抑制EMT，延缓肿瘤生长和转移[30]。另有circ-ITCH在食管癌细胞株Eca-109和TE-1中，可抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，导致癌细胞增殖能力、细胞周期进程和致瘤能力均受到抑制[5]。

3 环状RNAs在消化道肿瘤的诊断及预后判断的应用

由于环状RNAs具有高度的稳定性，不易被核酸外切酶降解，故环状RNAs可以在细胞内不断累积[31]。环状RNAs的一个可能排泄机制是EVs，EVs是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的囊泡状小体，其内包含有RNA、蛋白质和脂类等多种细胞成分，在许多体液，如血液、尿液或唾液中都可以发现EVs的存在，根据它们的合成或释放途径，可以将EVs分为不同的亚型，其中外泌体是研究最为热门的亚型[32]。Li等[33]研究表明，环状RNAs可存在于于外泌体和血浆中，外泌体中的环状RNAs表达量是产生环状RNAs的癌细胞的3倍以上；此外，他们研究团队还发现，环状RNA circ-KLDHC10在结直肠癌患者血清中的表达水平比健康人群血清高。近期，环状RNA hsa-circ-0000190被发现是胃癌诊断的一个潜在的生物标志物，其在胃癌组织和血浆中均表达下调，与CEA和CA19-9这两个经典的生物标志物相比，hsa-circ-0000190具有更好的敏感性和组织特异性，has-circ-0000190有望成为有助于胃癌诊断的一种非侵入性的生物标志物[9]。另一方面，胃癌患者术后血浆中环状RNA has-circ-002059与术前相比有显著差异，且其低表达水平与远端转移、TNM分期、性别和年龄相关[34]。因此，与肿瘤组织相比，外泌体或血浆中环状RNAs稳定表达为肿瘤诊断提供更为便捷的方式。

综上所述，环状RNAs高度稳定，且不易被核酸外切酶降解，能够存在于外泌体和血液中，在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌中表达异常，具有微小RNA海绵、参与蛋白翻译、调控基因转录及剪切等功能，通过多种信号通路在消化系肿瘤发生、发展及转移中发挥重要调控作用，并且可以作为分子标志物用于消化道肿瘤的诊断和预后判断。但环状RNAs在消化道肿瘤中的作用仍处于推测阶段，需更大样本、更多数据和细胞实验进一步证实，其最终是否能够真正应用于肿瘤诊断与治疗仍未可知。肿瘤细胞中环状RNAs的功能、环状RNAs检测方法的优化、寻找可以作为肿瘤诊断标志物或治疗靶点的环状RNAs是今后的研究方向。

[1] Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: a new star of noncoding RNAs[J]. Cancer Lett, 2015,365(2):141-148.

[2] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013,495(7441):333-338.

[3] Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013,495(7441):384-388.

[4] Salzman J, Gawad C, Wang PL, et al. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J]. PLoS One, 2012,7(2):e30733.

[5] Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6001-6013.

[6] Xia W, Qiu M, Chen R, et al. Circular RNA has_circ_0067934 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and promoted proliferation[J]. Sci Rep, 2016,6:35576.

[7] Pan H, Li T, Jiang Y, et al. Overexpression of circular RNA ciRS-7 abrogates the tumor suppressive effect of miR-7 on gastric cancer via PTEN/PI3K/AKT signaling pathway[J]. J Cell Biochem, 2017,9999:1-7.

[8] Chen J, Li Y, Zheng Q, et al. Circular RNA profile identifies circPVT1 as a proliferative factor and prognostic marker in gastric cancer[J]. Cancer Lett, 2017,388:208-219.

[9] Chen S, Li T, Zhao Q, et al. Using circular RNA hsa_circ_0000190 as a new biomarker in the diagnosis of gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2017,466:167-171.

[10] Dou Y, Cha DJ, Franklin JL, et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes[J]. Sci Rep, 2016,6:37982.

[11] Weng W, Wei Q, Toden S, et al. Circular RNA ciRS-7-A promising prognostic biomarker and a potential therapeutic target in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res, 2017,23(14):3918-3928.

[12] Xu L, Zhang M, Zheng X, et al. The circular RNA ciRS-7 (Cdr1as) acts as a risk factor of hepatic microvascular invasion in hepatocellular carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2017,143(1):17-27.

[13] Guo W, Zhang J, Zhang D, et al. Polymorphisms and expression pattern of circular RNA circ-ITCH contributes to the carcinogenesis of hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2017,8(29):48169-48177.

[14] Li H, Hao X, Wang H, et al. Circular RNA expression profile of pancreatic ductal adenocarcinoma revealed by microarray[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,40(6):1334-1344.

[15] Zhang P, Guo Z, Hu R, et al. Interaction between microRNA-181a and TNFAIP1 regulates pancreatic cancer proliferation and migration[J]. Tumour Biol, 2015,36(12):9693-9701.

[16] Takiuchi D, Eguchi H, Nagano H, et al. Involvement of microRNA-181b in the gemcitabine resistance of pancreatic cancer cells[J]. Pancreatology, 2013,13(5):517-523.

[17] Kartha RV, Subramanian S. Competing endogenous RNAs (ceRNAs): new entrants to the intricacies of gene regulation[J]. Front Genet, 2014,5:8.

[18] Saydam O, Senol O, Würdinger T, et al. miRNA-7 attenuation in Schwannoma tumors stimulates growth by upregulating three oncogenic signaling pathways[J]. Cancer Res, 2011,71(3):852-861.

[19] Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6001-6013.

[20] Wang Y, Wang Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs[J]. RNA, 2015,21(2):172-179.

[21] Abe N, Matsumoto K, Nishihara M, et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells[J]. Sci Rep, 2015,5:16435.

[22] Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis[J]. Mol Cell, 2017,66(1):22-37.

[23] Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, et al. Translation of CircRNAs[J]. Mol Cell, 2017,66(1):9-21.

[24] Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the Nucleus[J]. Nat Struct Mol Biol, 2015,22(3):256-264.

[25] Zhang Y, Zhang XO, Chen T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Mol Cell, 2013,51(6):792-806.

[26] Ashwal-Fluss R, Meyer M, Pamudurti NR, et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing[J]. Mol Cell, 2014,56(1):55-66.

[27] Chou YT, Lin HH, Lien YC, et al. EGFR promotes lung tumorigenesis by activating miR-7 through a Ras/ERK/Myc pathway that targets the Ets2 transcriptional repressor ERF[J]. Cancer Res, 2010,70(21):8822-8831.

[28] Okuda H, Xing F, Pandey PR, et al. miR-7 suppresses brain metastasis of breast cancer stem-like cells by modulating KLF4[J]. Cancer Res, 2013,73(4):1434-1444.

[29] Zhang H, Cai K, Wang J, et al. MiR-7, inhibited indirectly by lincRNA HOTAIR, directly inhibits SETDB1 and reverses the EMT of breast cancer stem cells by downregulating the STAT3 pathway[J]. Stem Cells, 2014,32(11):2858-2868.

[30] Zhao X, Dou W, He L, et al. MicroRNA-7 functions as an anti-metastatic microRNA in gastric cancer by targeting insulin-like growth factor-1 receptor[J]. Oncogene, 2013,32(11):1363-1372.

[31] Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs[J]. Cell, 2015,160(6):1125-1134.

[32] Harding CV, Heuser JE, Stahl PD. Exosomes: looking back three decades and into the future[J]. J Cell Biol, 2013,200(4):367-371.

[33] Li Y, Zheng Q, Bao C, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis[J]. Cell Res, 2015,25(8):981-984.

[34] Li P, Chen S, Chen H, et al. Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2015,444:132-136.

贵州省科技厅、遵义医学院、遵义市科技局联合基金资助项目(LKZ[2013]-13号)。

吴会超(E-mail： wuhuichao985@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.034

R735

A

1002-266X(2017)40-0100-04

2017-07-17)