影响猪瘟疫苗质量的几个关键因素分析

师新川/华威特（江苏）生物制药有限公司

影响猪瘟疫苗质量的几个关键因素分析

师新川/华威特（江苏）生物制药有限公司

猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的以高热和出血为特征的，高度接触性、致死性传染病，严重危害养猪业生产。我国自1956年开始使用猪瘟兔化弱毒疫苗以来，猪瘟疫情逐步得到了控制。虽然我国驯化的猪瘟兔化弱毒疫苗毒株（C株）是目前世界上最优秀的猪瘟疫苗毒株且在我国广泛使用多年，但猪瘟在我国仍时有发生。其可能原因之一是猪瘟疫苗质量跟不上当前防疫的完全需求。笔者根据自己从事动物疫苗研发、生产和技术服务的工作体会，结合相关研究文献，谈谈影响猪瘟疫苗质量的几个关键因素。

一、病毒培养的方式

根据猪瘟制苗用病毒培养的方式，大体把猪瘟疫苗分为猪瘟脾淋组织苗、猪瘟原代细胞苗和猪瘟传代细胞苗，其各自特点分别为。

（一）猪瘟脾淋组织苗

猪瘟脾淋组织苗系用猪瘟兔化弱毒株接种健康乳兔或成年家兔，收获感染定型热兔子的脾脏及淋巴结，在其组织匀浆中加入适宜稳定剂，冷冻真空干燥而成。组织苗每头份病毒抗原含量不低于150个兔体感染量（RID），其中所含的多种淋巴因子能迅速增强机体非特异性免疫，但其异源性又可能造成猪的过敏反应。此外，在生产制备脾淋组织苗时难以杜绝由动物脏器带入的外源微生物污染，增大了使用时应激反应发生的频率。国内曾有报道，30日龄以内仔猪首免时接种脾淋苗，发生过大量过敏现象。接种日龄越小，反应愈强烈，严重的引起仔猪死亡。过敏反应还可能引起妊娠母猪发热，流产等反应。故乳猪的超前免疫及妊娠母猪的免疫应慎用此类制品。

（二）猪瘟原代细胞苗

猪瘟原代细胞苗是把猪瘟兔化弱毒接种于犊牛睾丸原代细胞培养，在其培养物加入适宜稳定剂后冷冻真空干燥制成。猪瘟原代细胞苗相对于脾淋组织苗抗原含量较高，免疫原性良好，每头份病毒含量不低于750RID。猪瘟原代细胞苗在抗原培养过程中，其培养液、培养温度、培养时间及其他环境条件可控，是有利生产稳定疫苗毒的一面。不利于质量控制的是，它使用的原代牛睾丸细胞容易把牛源病原体带入猪瘟抗原中，例如导致牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染。BVDV可感染猪而引起疑似猪瘟病症，并严重干扰猪瘟疫苗的免疫效果。此外，制苗所用的牛睾丸原代细胞一般采自3月龄左右犊公牛，动物个体差异大进而导致疫苗的批间差异大，对疫苗生产和效力发挥带来潜在的困难。此类疫苗中一般存在一定量的血清和少量的细胞碎片，不能完全避免使用时的应激反应。

（三）猪瘟传代细胞苗

与原代细胞苗不同，猪瘟传代细胞苗，用传代猪睾丸细胞或牛睾丸细胞制备疫苗抗原。可进一步避免外源微生物的污染，生产工艺非常稳定，质量易控，批间差异极小，病毒产量高，可达原代细胞苗的20倍以上。传代细胞苗的抗原在培养后期，可大幅度降低血清使用量，进一步减少因异源蛋白引起的过敏反应。所以猪瘟传代细胞疫苗安全性好，免疫效力高，在紧急免疫时更能展现其优势。

二、制备疫苗的原辅料对猪瘟疫苗质量的影响

这里的原辅料主要是指对疫苗抗原产量、纯度及稳定性有影响的材料。能明显影响猪瘟疫苗质量的原辅材料基本上都与BVDV有关。BVDV与猪瘟病毒的生物学特性相近，可感染包括猪在内的多种动物。材料中若含有BVDV的抗体，则会抑制疫苗抗原的生长，产品中的抗原含量就达不到要求，进而达不到防疫效果。如果材料被BVDV污染，疫苗接种后有使猪感染BVDV的风险。猪瘟细胞苗在生产过程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等材料，需要对这些材料做BVDV抗原和抗体的严格检验。

（一）原辅料对猪瘟疫苗质量的影响

BVDV与猪瘟病毒有一定的共同抗原，所以BVDV抗体对猪瘟病毒有一定的中和作用，严重干扰猪瘟病毒侵入宿主细胞增殖和扩繁的能力。笔者曾对市场上3个厂家9个批次的牛血清进行检验，结果只有1个批次的血清BVDV抗体为阴性，其余血清的中和抗体效价在1∶16～1∶128之间。分别用于细胞培养猪瘟兔化弱毒72 h免疫荧光检测病毒含量最高为102．5FAID50/ ml，而使用BVDV抗体阴性牛血清所产病毒含量为107．6FAID50/ml，两者相差10万倍。显而易见，在临床感染BVDV猪所产生的中和抗体可以干扰猪瘟疫苗的效力。

在猪瘟细胞苗的生产过程中，由牛源原代睾丸细胞或牛血清引入的BVDV可导致临床疾病。在荷兰报道使用受BVDV污染的疫苗而引起仔猪牛病毒性腹泻病毒的感染，感染仔猪出现与猪瘟类似的症状与病变。此外，法国一猪场由于注射了用次代羔羊肾细胞生产的伪狂犬病弱毒疫苗而引起母猪产仔数下降和产畸形仔猪，后来证实此疫苗有BVDV污染。目前我国猪瘟细胞苗的生产厂家众多，原辅材料的纯净度难以控制，接种猪瘟疫苗时的生物安全风险不容忽视。

（二）血清质量管理

血清作为疫苗生产的重要原辅料，从服从终产品质量的角度，兽用生物制品企业把无外源微生物污染和促细胞生长活性作为衡量血清质量的两个重要指标。

除了BVDV外，支原体也是血清常见的污染原，受其污染的疫苗制品极易诱发猪的应激反应。支原体污染具有很强的隐蔽性，用肉眼难以观察，所以需要有严格的支原体检测手段。按照现有兽药检验标准，必须在无血清的支原体培养基检验支原体，单次检验周期长达4周。考虑到人员和环境等因素，为保证无支原体污染，优秀的生物制品企业一般会增加额外的快速检验手段，如PCR法。

血清作为细胞生长的主要营养物质，对细胞的生长状态和生长速度起到决定性的作用，而细胞状态又直接决定了病毒生长的数量和质量。如何确定血清的促生长活性，目前尚无严格的标准，不同企业的内控方法有所差异。一般根据加入特定量血清后，细胞的生长状态、生产病毒的滴度、收获期的长短综合评价，需要有较多的经验。

三、耐热冻干保护技术

猪瘟兔化弱毒活疫苗对高温敏感，所以运输、保存条件对猪瘟疫苗的质量影响很大。活疫苗从出厂到使用，中间的运输和保存都需要在冷藏条件下进行。“冷链”中的任何一个环节出现问题，疫苗效价就会降低甚至失效。

我国现在商品化的猪瘟疫苗多采用比较简单的保护剂，其主要成份为蔗糖、脱脂牛奶和明胶。这类制品对温度仍比较敏感，需在-15℃保存。在保存和使用期间，如果遇到温度较大变化或者多次变化，疫苗的质量就会下降。因而在生产实践中，许多技术人员发现，疫苗的批间免疫效力差异比较大，防疫效果难以控制。这一问题运输不便的地区以及小型养猪场，更为常见。随着我国对动物疫苗品质的要求越来越高，各疫苗研发和生产企业不断进行工艺探索，这一问题正在得到改善。我们的研究表明，理想的耐热冻干保护剂能满足猪瘟疫苗在2℃～8℃条件下，保存超过24个月。随着这一技术的使用，疫苗变得很稳定、批间差异很小，并使仔猪一次接种获得免疫成为可能，大大提高了疫苗的免疫成功率和免疫保护率。耐热冻干保护水平目前是评判猪瘟疫苗品质高低的关键指标之一。

四、猪瘟疫苗的效力评判标准

“疫苗出了错，都是标准惹的祸”一句简单的话语，道出了标准对于疫苗的重要性。猪瘟病毒由于自身在生产和检验细胞上不出现细胞病变，所以在病毒含量测定时，不能通过观察细胞病变来读取结果。目前猪瘟病毒的效力检验有三种方法，分别是猪免疫攻毒、兔体感染定型热、免疫荧光定量（FAID50），这三种方法分别都有各自的评判标准及优缺点。

（一）免疫攻毒法

免疫攻毒法是猪瘟效力检验的金标准，既对猪瘟抗体阴性健康仔猪，免疫猪瘟疫苗10～14日后连同对照一块使用高致病性猪瘟（石门系血毒）进行攻击保护实验。攻毒后免疫组保护，对照组发病，则判定该批次疫苗合格。其优点是有效、直接，但生物安全风险大、强毒获取困难、需要负压动物房、成本高，因而并未被广泛采用。

（二）兔体定型热检测法

兔体定型热检测法，顾名思义既是将猪瘟疫苗注射到兔子体内，通过兔体的体温反应来判定疫苗是否合格。其优点是不动用强毒无生物安全风险，兔子属小动物便于实验操作，成本低。

但兔子的品种、产地、体重、健康状况等对结果的影响较大，因不可控因素太多，常出现结果无法判定的情况。它不能直接反映疫苗的病毒含量，当然也不能对猪瘟疫苗病毒含量进行准确、稳定的评判。

（三）免疫荧光定量法

免疫荧光定量法通过单特异的猪瘟病毒单克隆抗体，将无细胞病变的猪瘟病毒进行荧光染色，然后在荧光显微镜下直接判定。疫苗病毒感染细胞浆内将显示特异的荧光信号，这是在细胞水平对病毒进行定量，是国际标准猪瘟病毒含量测定方法。因该方法完全在实验室条件下操作，不受地域、环境等条件的制约，所以稳定性好，同时该方法还具有直接、准确的检测猪瘟疫苗病毒含量的优点，被认为最精准的猪瘟病毒定量方法。过去由于缺少可用于标准化检验的猪瘟单克隆抗体，这一质量分析法在我国没有应用。经过数年的研究，华威特生物制药有限公司的研究人员解决了这一技术中的难题，猪瘟免疫荧光定量方法在农业部2270号公告中确认为猪瘟疫苗效力检验标准。这一技术的使用，将让猪瘟疫苗的制备更精确化、标准化、可控化，减少产品批间差，降低因疫苗批次的不稳定而带来的免疫风险。

五、小结

猪瘟疫苗病毒抗原的培养方式、原辅料品质、耐热冻干保护技术是影响猪瘟疫苗质量的重要因素。传代细胞培养疫苗，抗原纯净，抗原含量充分，可最大限度减少外源病毒污染，不论是安全性还是免疫效力，均能满足当前猪瘟防疫的需要。免疫荧光定量及高效耐热保护技术的应用，将使猪瘟疫苗的品质得到全面提升，有重大的社会和经济价值。

高质量的猪瘟疫苗只是猪瘟有效防控的前提条件，合理的免疫程序及对猪场猪瘟状况的准确判断，同样是猪瘟有效防控的重要条件。猪瘟防控是系统防疫的一部分，蓝耳病、圆环、伪狂犬等疾病，同样是导致猪瘟免疫失败的重要因素，我们必须遵循各自的根本原则，根据不同猪场的实际情况，制定周密合理的免疫方案及相应的周期性检测计划，让猪瘟防疫给猪场带来更好的效益。