水貂阿留申细小病毒的致病机制、鉴定及防治方法

卞大伟 （辽宁省畜产品安全监察所 辽宁 沈阳 110003）

水貂阿留申细小病毒的致病机制、鉴定及防治方法

卞大伟 （辽宁省畜产品安全监察所 辽宁 沈阳 110003）

水貂阿留申细小病毒(Aleutian mink disease parvo virus，AMDV)是感染水貂的自主复制型细小病毒，是引起水貂阿留申病的病原。AMDV感染水貂后会产生抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibody-dependent enhanceme nt，ADE)，还没有效果较好的疫苗进行防控。本文主要对AMDV的致病机制及目前的鉴定和防治方法进行综述。

水貂阿留申细小病毒是感染水貂的自主复制型细小病毒，给世界范围的水貂养殖业造成巨大损失[1]。AMDV根据不同的病毒株、水貂年龄、免疫状态等因素，可引起不同的疾病，AMDV感染血清反应阴性的幼貂，可在肺泡II型细胞高效复制，引起急性致死性间质性肺炎，而感染成年貂，则主要感染淋巴结巨噬细胞，呈低水平病毒复制，引起以脾肿大、高丙种球蛋白血症、浆细胞增多、动脉炎、免疫复合物型肾小球肾炎为特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力底下[1,2]。目前，对于AMDV，还没有公认的效果较好的疫苗，也没有特效的治疗方法，只能通过检疫、淘汰病貂等方法来净化貂群，进行防控。本文根据AMDV致病机制的研究进展，对目前AMDV的鉴定和防治方法进行综述。

1 AMDV基本特征及致病机制

（1）AMDV属于细小病毒科(Parvoviridae)阿留申细小病毒属(Amdoparvovirus)成员，基因组为单股线性负链DNA，长约4800nt，两端回文序列形成复杂的发夹结构，中间序列含有两个开放阅读框(ORFs)，左端ORF编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3，其中NS1是主要的多功能蛋白，在病毒的转录和复制过程中发挥重要作用；右端ORF编码结构蛋白VP1和VP2，其中VP2是主要的衣壳蛋白，占衣壳蛋白的90%，含有主要的抗原决定簇[3～6]。病毒粒子无囊膜，直径约24～26nm，呈正二十面体对称，结构结实紧密，对外界环境抵抗力强，耐热，并能耐受氯仿等有机溶剂[7]。在体外，AMDV能在猫肾细胞系CRFK细胞中复制，最适培养温度32℃。（2）AMDV与其它自主复制型细小病毒相比有其特殊的致病机制。如上所述，不含母源抗体的幼貂感染AMDV致病株，可在感染后2～3周即产生暴发性的间质性肺炎，致死率达90%以上[8]。而幼貂在出生一周后感染AMDV，则产生肺炎的几率会显著降低，而是会产生成年貂感染AMDV的症状，即机体快速产生抗病毒抗体，病毒则呈持续性感染[9]。成年貂感染AMDV的症状与病毒毒株及水貂基因型有关。AMDV的致病株AMDV-Utah具有较强致病性，在成年貂体内呈持续性感染，导致免疫系统紊乱，但在体外CRFK细胞中复制效率低，而AMDV的弱毒株AMDV-G则能在CRFK细胞中高效复制，但在体内无致病性[5,10]。AMDV感染后可快速刺激机体产生抗病毒抗体，抗AMDV抗体与病毒粒子结合形成感染性的免疫复合物，沉积在血管和肾小球处，导致高丙种球蛋白血症和肾小球肾炎等症状。免疫过的成年貂虽然已产生保护性抗体，但并不能使其免于AMDV的感染，反而会加快疾病进程，即抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibody-dependent enhancement，ADE)。这是因为AMDV可通过与抗体结合形成的免疫复合物，进一步与巨噬细胞表面Fc受体或补体受体结合，从而促进AMDV进入巨噬细胞，将AMDV与已感染水貂的血清预先孵育后，再感染巨噬细胞，其感染效率可提高10倍[11]。而幼貂免疫后产生的抗体则能保护幼貂免于产生致死性肺炎，这与AMDV感染幼貂的靶细胞是肺泡II型细胞有关。虽然抗体能够促进AMDV感染巨噬细胞，但仅有少量巨噬细胞能产生AMDV mRNA，说明AMDV在巨噬细胞内并没有起始感染，存在其他机制限制病毒复制，使病毒呈持续性感染，进一步影响体内免疫系统[12]。研究表明，抗体结合AMDV的主要位点是VP2蛋白的428～446位氨基酸，抗VP2∶428～446的抗体能够凝集病毒粒子形成免疫复合物，介导ADE[13]。AMDV-G感染CRFK细胞可引起细胞凋亡，用凋亡蛋白酶3(caspase 3)或广谱蛋白酶抑制剂预先处理CRFK细胞，可以抑制病毒引起的凋亡，但同时发现，抑制凋亡会显著降低感染性病毒粒子的产量，说明在体外，AMDV的高效复制依赖于特异凋亡蛋白酶的激活[14～16]。目前，AMDV的ADE机制还存在很多未解问题，需进行深入研究，以期寻求防治AMDV的有效方法。

2 AMDV的鉴定

2.1 病毒粒子的鉴定 随着全基因组测序技术的快速发展，各种PCR技术的不断创新，使AMDV的全基因组测序成为可能。Jensen等通过PCR扩增NS1基因的374bp片段检测水貂组织样品中的AMDV，与对流免疫电泳方法相比，其相对敏感性达97.9%[17]。由于AMDV对外界环境抵抗力强，可能长期存在于被污染的貂场中，Prieto等为了检测貂场中的环境样品是否污染了AMDV，建立了实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，AMDV感染的貂场中93.9%的环境样品都显示AMDV阳性，没有AMDV感染的貂场或已进行过杀毒处理的貂场的检测结果呈阴性，与动物直接接触的样品所污染的AMDV水平最高[18]。PCR和qPCR检测方法灵敏度高，耗时较少，但需要特殊的仪器和专业技术，因此比较适合应用于实验室检测，却不适用于大规模检测。Zhang等优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)来检测AMDV，设计6个特异引物扩增VP2基因的特异序列，在等温条件下(65℃水浴)，45min即可完成扩增反应，利用荧光染料用肉眼即可观察检测结果，不需要特殊仪器，具有简单、特异、快速、成本低的特点，比普通PCR灵敏度更高(图1)[19]。LAMP技术方法有潜力成为AMDV的有效诊断工具，特别是在没有特殊仪器的野外条件下，应用前景更好。

2.2 抗AMDV抗体的鉴定 （1）PCR方法检测AMDV感染，在感染早期，其敏感性显著高于对流免疫电泳技术(coun-terimmunoelectrophoresis，CIEP)，但是由于病毒血症和粪便排毒时间呈间歇性，PCR应用有一定限制[20]。感染后24周仍能检测到AMDV抗体，因此可以通过抗体检测来鉴定AMDV感染。常规的AMDV抗体检测方法是CIEP，基于抗原抗体特异性反应，在琼脂糖凝胶电泳时，抗原由负极向正级移动，抗体由正极向负极移动，两者相遇形成灰白色沉淀线[21]。抗原可以是来源于组织或细胞培养物的全病毒抗原，也可以是基因工程抗原。Clemens等将VP1和VP2基因编码序列插入重组牛痘病毒，重组病毒VV∶ADSP感染细胞后能够成功表达VP1和VP2蛋白，并且VP2蛋白能够自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)；接种VV∶ADSP能够产生抗AMDV抗体；将重组表达产物作为抗原进行CIEP试验检测正常和患病水貂的血清，其特异性与标准ADV抗原相同[22]。Knuuttila等利用昆虫杆状病毒系统成功表达了结构蛋VP2，并自我组装形成VLPs，纯化后的VLPs作为抗原进行CIEP，与传统CIEP抗原相比，两者符合率达到100%[23]。国内曾祥伟等将VP2基因的主要抗原区进行原核表达，将表达蛋白纯化后作为抗原进行CIEP，与传统CIEP结果相比较，改进的CIEP方法具有较高的敏感性和特异性，血清检出率更高，两者检测符合率达94.3%[24]。全病毒抗原存在散毒危险，脏器抗原制备繁琐，细胞抗原的病毒效价较低，病毒浓缩和纯化成本较高，相比而言，基因工程疫苗特异性较好，且无散毒危险，正逐渐被推广应用。（2）CIEP方法检测AMDV感染，具有较好的特异性和敏感性，被作为抗体检测技术的“金标准”，但是试验过程需要复杂的仪器，并且结果判定存在主观性，可能导致假阳性的判定。Knuuttila等在利用VLPs作为抗原进行CIEP的同时，还进行了酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，将VLPs作为包被抗原，HRP标记的羊抗猫抗体作为二抗，检测316份水貂血清样品，并将ELISA和CIEP结果进行了比较，结果显示ELISA与CIEP检测结果相一致，可以应用于AMDV感染检测，并建议推广应用[23]。Andersson和Wallgren对以AMDV病毒为抗原的ELISA方法和以AMDV VP2蛋白为抗原的ELISA方法进行比较，并以传统CIEP方法为金标准进行比较。与CIEP相比，VP2-ELISA的敏感性和特异性分别为99.7%和98.3%，而AMDV-ELISA的敏感性和特异性仅为37.6%和98.3%，因此，推荐VP2-ELISA作为诊断方法代替CIEP检测AMDV抗体。Chen等将VP2蛋白的主要抗原区(332～452位氨基酸片段)进行原核表达，表达的重组蛋白VP2332-452纯化后作为抗原进行ELISA，检测水貂血清样品，与传统CIEP相比，VP2332～452ELISA的特异性和敏感性分别达97.9%和97.3%，表明VP2332～452可以作为抗原进行ELISA检测AMDV感染[25]。同年，Ma等预测了6个AMDV VP2抗原性肽段，即氨基酸P1(288～309)，P2 (325～340)，P3(415～433)，P4(514～532)，P5(556～567)和P6(604～616)，人工合成这6个肽段，并在多肽的N端或C端加一个半胱氨酸，再交联一个卵清蛋白(OVA)，重组蛋白作为抗原进行ELISA，对各肽段的抗原性的检测结果表明，P1的抗原性最好；用含有P1的重组蛋白作为抗原，检测764份水貂血清样品，与传统CIEP相比，ELISA的敏感性和特异性分别达98.0%和97.7%，两者一致性达97.9%；同时，比较了ELISA和CIEP对感染早期的血清样品的检测结果(共342份血清样品，PCR检测AMDV基因组阳性，而CIEP检测AMDV抗体阴性)，ELISA检测的阳性样品149份，阳性率为43.6%；敏感性和特异性检测结果表明利用VP2多肽为抗原的ELISA比CIEP的敏感性更高，特异性更好[26]。ELISA方法检测抗体，克服了CIEP的主观性，可自动化操作，且敏感性比CIEP更高，更适于检测AMDV感染。各研究结果表明，VP2-ELISA比AMDVELISA的敏感性和特异性更高，适于用来检测AMDV感染，但需要利用昆虫杆状病毒系统表达大量的VP2蛋白，并需要进行纯化，成本较高，而原核表达VP2抗原肽段或合成肽，既降低了蛋白表达和纯化的成本，又有较高的敏感性和特异性，更适于作为抗原进行ELISA检测AMDV感染。（3）间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay, IFA)也可用于抗原抗体反应，但此方法多用于实验室内的病毒检测和蛋白功能鉴定等。经典的碘凝集试验(Iodine agglutination test，IAT)也可以检测AMDV感染，将新配置的鲁戈氏碘液与血清样品混合，若产生褐色絮状凝集物，说明存在AMDV感染[27]。此法简单，不需要特殊仪器，适合于大群初筛检查，但此法特异性差，需配合PCR或其他抗体检测技术进一步鉴定。徐磊原核表达AMDV VP2的2个抗原片段，并将其作为标记抗原，制备胶体金试纸条检测血清样品，与CIEP检测结果相比，胶体金免疫层析法的敏感性是CIEP的2倍，特异性较好，该方法操作简单，成本较低，不需要特殊仪器，适用于自动化检测，有较好的应用前景[28]。

3 AMDV的防治

1998年，Aasted等研究发现，AMDV衣壳蛋白VP1/2作为疫苗接种水貂后，促进了接种水貂的疾病进程，具有较高的死亡率；而接种NS1蛋白的水貂，与未接种水貂相比，AMDV感染引起更温和的阿留申疾病，说明NS1疫苗起到了一定程度的保护作用[29]。2005年，Castelruiz Y等的研究结果同样证明了NS1蛋白接种水貂能起到一定的保护作用[30]。水貂养殖主要是为了获得皮毛，目前对AMDV的防控主要通过种貂检疫和病貂扑杀等方式进行，养殖过程中，要注意定期消毒，防止交叉传播。

4 结论

自1956年水貂阿留申病被发现以来，由于AMDV感染后的ADE现象，很难通过研制有效的疫苗来防控AMDV的感染，对ADE机制的进一步深入研究对于有效疫苗的研制至关重要，疫苗必须根据相关机制避免产生ADE，或者引入调控因子对免疫系统进行调控，减少病理损伤。目前，虽然没有有效的疫苗，但各国研究者不断创新AMDV的检测方法，通过定期对AMDV病貂筛查的方式淘汰病貂，从而净化貂场来防控AMDV感染。

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山东畜牧兽医学会简介

山东畜牧兽医学会成立于1952年12月，是一个学术性社会团体，是在中国共产党领导下的社会法人团体，接受山东省科协业务主管领导和山东省民间组织管理局监督和管理，挂靠在山东农业大学。学会现已换届八次，下属16个专业委员会，有个人会员3150人，单位团体会员16个，个人会员中有高级会员98人，女性会员267人。学会自成立以来进行了大量的学术活动和科普工作，为山东乃至全国的畜牧业发展做出了积极的贡献，因此，连续15年被山东省科协评为“先进省级学会”，并获得“学会之星”荣誉称号。本会2011年在中国畜牧兽医学会等十三届代表大会上被评为“先进集体”。

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1007-1733(2017)04-0062-04

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