流式细胞术的发展历史及在兽医学中的应用

王琳

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）

流式细胞术的发展历史及在兽医学中的应用

王琳

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）

流式细胞术作为一种对单细胞定量分析和分选的新技术已广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等研究领域，文章对其发展及在兽医学中的应用作以综述。

流式细胞术；发展；应用

Abstract:As a new technique for single cell quantitative analysis and separation,flow cytometry has been widely used in research field of immunology,hematology,oncology,cell biology,cytogenetics, biochemistry and so on.This article reviewed the development and application of flow cytometry in veterinary medicine.

Key words:flow cytometry;development;application

流式细胞术（FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光显微镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代比较先进的细胞定量分析技术[1]。

1 流式细胞术的发展历史

1.1 流式细胞术仪器的发展

1930年Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数；1934年世界上最早设想使细胞检测自动化的人Moldaven试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量，开创了流式细胞自动计数的基础；1936年Caspersson等引入显微光度术；1940年Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；1949年Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；1950年Caspersson用显微分光光度计在紫外（UV）和可见光光谱区检测细胞；1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；1954年Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器；1959年B型Coulter计数器问世；1965年Kamemtsky等提出两个设想：用分光光度计定量细胞成分和结合测量值对细胞进行分类；1967年Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；1969年Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明第一台荧光检测细胞计；1972年Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号[2]。进入20世纪80年代和90年代，流式细胞仪除了在70年代仪器基础上进行完善多光束、多参数技术外，在技术原理和设计研制方面似乎没有突破性的进展。

现今流式细胞仪在各种功能上有很大提高，随着光电技术的进一步发展，流式细胞仪已开始向模块化发展，即其光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照实验要求随意更换[3]。进入21世纪，流式细胞术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。

1.2 流式细胞术方法学的发展

从FCM发展史看，初始10年是以测定单细胞内DNA含量或RNA含量、蛋白质或线粒体等大分子结构，研究细胞增殖动力学为重点。在20余年中，FCM方法学的发展十分迅速。1974年Hoffman和Laris首先用FCM检测了红细胞的膜电位；1975年Milstein和Köhler建立了单克隆抗体技术；1979年Kung等就用该技术在FCM上区分了人类T淋巴细胞亚群抗原。以后Loken又利用单激光束研究了同一细胞的两种抗原。1975年Gratzner等建立溴脱氧尿嘧啶核苷掺入增殖细胞，用FCM检测的方法了解了细胞的增殖活性。1976年Darzynkienicz等建立对同一细胞DNA-RNA相关测量的方法[4]。1979年Visser等用FCM测量了细胞中pH的变化。Valet等建立了用FCM测量细胞表面电荷的方法。1980年Thorell建立了用FCM测量细胞内氧化还原状态的方法。1982年Oi发明了新一代免疫荧光染料——藻胆蛋白系列，拓宽了FCM的研究领域，使荧光免疫技术有了进一步的发展。近几年随着流式细胞术的发展，在一个样品可以同时检测双色、三色及四色荧光染料标记的单克隆抗体，这对研究不同抗原间的关系提供了方便，使流式免疫荧光标记研究也获得了充分发展[5]。近年来出现了许多FCM的灵活数据分析软件，以不同图像显示多参数之间的相关性，进一步推动了FCM技术的发展[6]。

2 流式细胞术在预防兽医学中的应用

2.1 淋巴细胞亚群分析

人及动物体内白细胞表面标志是评价机体免疫状态的基础。流式细胞术不仅能检测机体3大免疫细胞的数量，包括T细胞（CD3+CD19-细胞）、B细胞（CD19+CD3-细胞）和NK细胞（CD3-/CD（16+56）+细胞），而且还可以检测3大免疫细胞的活性细胞水平，包括活性T细胞（CD3+/HLA-DR+细胞）、活性B细胞（CD19+/CD5+细胞）和活性NK细胞（CD（16+56）+/Fas配体+细胞）。T细胞是机体免疫的核心细胞。末梢血T细胞发育为功能不同的亚群，各亚群的数量和功能发生异常时，就可能导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。在各种疾病发生发展过程中用不同的T细胞表型标志物来测定人外周血细胞中T辅助/诱导细胞亚群（CD3+CD4+细胞）和T抑制/细胞毒细胞亚群（CD3+CD8+细胞），及二者的比值（CD3+CD4+/CD3+CD8+）来评价体内细胞免疫调节平衡状态。利用CD4和CD29、CD45-RA单克隆抗体可以将CD4细胞群分为CD4+CD45RA+的T抑制细胞诱导亚群及CD4+CD29+的T辅助细胞诱导亚群；也可以利用CD8和CD28单抗将CD8细胞分为CD8+CD28+的细胞毒T细胞亚群和CD8+CD28-的T抑制细胞。T细胞亚群的检测可以帮助研究各种与免疫有关的疾病发病机制，特别是T细胞的免疫调节功能[6]。

2.2 微生物鉴别

流式细胞术可对大数量细菌逐个快速的进行多参数精确测量，现在多数用于对酵母菌和各类细菌的测量与分析。酵母菌的测量在技术上比较简单，自身体积大，其DNA含量约为人类二倍体细胞DNA含量的1/200。现在已用定量DNA、RNA和光散射方法来研究酵母菌的细胞周期。此外，也采用同样的方法对原生生物、藻类和霉菌类以及各种重金属对其的影响进行了研究。另外用FITC结合的抗血清可作种系鉴别，应用此项技术已能代替临床上经典的费时繁琐的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。在工业中，流式细胞术可用于快速微生物鉴定，如对饮用水及原油中的微生物鉴定与控制。

3 流式细胞术新技术的应用

3.1 液相芯片技术

生物芯片技术是近几年来随着人类基因组计划和蛋白质组计划的进展在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术，现已被大家所熟知。其将生物芯片技术和FCM有机结合在一起，把不同生物探针（核酸、蛋白等）标记在各种有荧光的微球上，以荧光标记微球作为反应载体在液相系统中完成生物学反应，即为流式细胞术液相芯片技术[7]。其组成由微球体+探针+目的分子+报告分子的一种简单反应模式，可以在同一液相中同时检测多个目的分子，如对血液中多种白细胞介素检测。

3.2 定量流式细胞分析

定量流式细胞分析是指采用流式细胞术对细胞或微粒上标记荧光分子的定量分析，从而对细胞的生物分子进行精确测量，如每个分子表达的平均分子数、抗原数等[8]。定量流式细胞分析不同于以往的相对荧光强度或阳性细胞百分率测量，更为准确、灵敏，如在获得性免疫缺陷综合征和“非典”的研究与治疗中，对外周血中的CD4+T淋巴细胞进行绝对记数，来反映病情进展及监测疗效[9]。

[1]左边富.流式细胞术与生物医学[M].沈阳∶辽宁科学技术出版社,1996.

[2]魏熙胤,牛瑞芳.流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展[J].现代仪器,2006（4）∶8-11.

[3]赵泓,刘凡.流式细胞仪[J].安徽农学通报,2006,12（12）∶39-41.

[4]Taylor J D,Briley D,Nguyen Q,et al.Flow cytometric platform for high-throughput single nucleotide polymorphism analysis[J].Biotechniques,2001,30（3）∶661-666.

[5]Alamo A L,Melnick S J.Clinical application of four and five-color flow cytometry lymphocyte subset immunophenotyping[J].Cytometry,2000,42（6）∶363.

[6]沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术（第二版）[M].武汉∶湖北科学技术出版社,2002.

[7]Hall S E,Dvorak W S,Johnston J S,et al.Flow cytometric analysis of DNA content for tropical and temperate new world pines[J].Annals of Botany,2000,86（6）∶1 081-1 086.

[8]Maecker H T.Cytokine flow cytometry[J].Methods Mol Biol,2004,263∶95-108.

[9]耿慧霞,王来,王强.流式细胞仪在生物学中的应用[J].生物学杂志,22（4）∶44-45.

The Development of Flow Cytometry and Its Application in Veterinary Medicine

WANG Lin

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Q291；S85

A

1001-0084（2017）09-0039-02

2017-08-06

王琳（1982-），女，辽宁锦西人，中级兽医师，主要从事疫苗生产。