HPLC指纹图谱在中药制剂质量研究中的应用＊

叶 婷，梁文仪，梁林金，李 师，吴玲芳，亓 旗，崔雅萍，陈文静，张兰珍

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

中药制剂是以中药材为原料制成的适用于应用的剂型，因中药药性温和、毒副作用小、不良反应轻，逐渐被视为较安全的预防和治疗疾病的药物。随着中药制剂的发展和市场需求的增加，中药制剂不良反应的报道也日益增多，质量问题越来越明显，而其质量的好坏涉及到原药材、成品及工艺中的每一个环节，故对中药制剂实行科学规范的质量监控不可或缺。

中国现行的中药质控模式从最初观察药材外观、性状及显微鉴别，到对药材进行薄层鉴别、内在成分的定量检测来衡量药材质量优劣，逐步向中药物质群整体指纹图谱定性、半定量、多指标药效成分定量及生物测定分析相结合的思路发展，其中指纹图谱整体性的特征促进了中药指纹图谱的提出和发展。

1 中药指纹图谱的定义及分类

中药指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手法，提取其信息并加以描述，得到能标示该中药材内在特征的色谱图或光谱图[1]。它是一种综合可量化的鉴定手段，常用于评价中药材、半成品、成品质量的真实、优劣及稳定性。“整体性”和“模糊性”是其主要特点，这和中医理论基础的整体性方面以及中药作用机制的模糊性是相互对应的[2]。

中药指纹图谱按测定手段分类可分为：中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱，化学指纹图谱在中药制剂分析方面应用广泛，对控制中药材质量具重要意义，主有光谱法和色谱法：如紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振谱（NMR），薄层色谱（TLC）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）及联用技术如HPLC/MS，HPLC/NMR，HPLC/MS/MS等。其中HPLC指纹图谱具高效、快速、样品适用性广等优点，已成为检测中药化学成分的普遍分析法，可有效体现中药成分的复杂性，而更好的评价中药制剂的内在质量。

2 HPLC指纹图谱在中药制剂中的应用

任何药物供临床使用前都必须制成适合于医疗或预防应用的形式，称为剂型，包括固体、半固体、液体及其他制剂等。在2000年由中国国家食品药品监督管理局提出，首先建立中药注射剂指纹图谱及相关质控要求，在注射剂指纹图谱基础上，逐步开展对中药材、半成品、成品制剂的指纹图谱研究。目前，指纹图谱在中药材方面，已建立了大部分药材的标准指纹图谱，中药制剂是由多味药以君臣佐使的原则配伍而成，化学成分复杂，其疗效并非任何一个活性成分可代表，亦不是多个化学成分药用作用的简单相加，而是经多成分、多靶点的协同作用，故采用指纹图谱技术对中药制剂进行质量控制具针对性和合理性[3]。

2.1 指纹图谱在固体制剂中的应用

固体剂型包括片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂等，应用最为广泛。其溶解速度慢、溶解度小、有效成分含量不均一等在固体剂型中较常见，不同厂家、不同批次的中药制剂有效成分含量存在较大差异性。指纹图谱应用于固体制剂中不仅可以可测出其有效成分含量多少，还可衡量其整体质量。

2.1.1 在片剂中的应用

目前，2015版《中国药典》[4]中片剂的质量控制主要采用HPLC法对其指标成分定量测定，用指标成分含量高低来评价其质量优劣。中医理论表明药材所有成分均对药效起一定作用，而对指标成分的控制难以全面反映其内在质量，故有学者建立HPLC指纹图谱来为其整体质量评价提供依据。分散片、咀嚼片及泡腾片等均由普通片剂发展而来，具崩解迅速，吸收快，生物利用度高等优点，其研制过程中应最大程度除杂来保留有效成分。分散片遇水可迅速崩解形成均匀的混悬液，而崩解不代表溶出，低溶出度会影响其质量，杨芳等[5]采用Aichrom Bond-AQC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-乙腈-水-冰醋酸，流速为1.0 mL·min-1，检测波长360 nm。以崩解时限、硬度为考察指标，优化枫蓼肠胃康分散片的制备工艺，测定枫蓼肠胃康分散片中芦丁含量及其溶出度，可更好地控制其质量。

口感不好是咀嚼片与泡腾片目前面临的主要问题，王雪[6]建立五味子咀嚼片的指纹图谱，采用Luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在220 nm下用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱，柱温35℃，检测波长220 nm，流速1 mL·min-1，进样量20 μL。筛选填充剂、矫味剂、润湿剂及润滑剂，改善咀嚼片的制备工艺，对比原药材与制剂的图谱，为其口感及多指标成分全面控制其质量提供依据。另杨志洁[7]等采用TLC与HPLC法鉴别制剂中各中药及制剂中盐酸小檗碱的含量，得所建立的标准可用于洁阴泡腾片的质量控制。另有刺五加脑灵泡腾片、复方草决明泡腾片、血塞通泡腾片等应用TLC法结合HPLC法为其质量控制及临床应用提供研究基础。除对制剂及其药材进行指纹图谱，曹艺[8]建立了归苓片血清药物化学指纹图谱，对给药后大鼠血中成分、来源生药及其代谢产物分析，得药物入血后成分不是单味药部位的血中移行成分简单加和，而是经配伍后的相互作用。

另有学者对益心舒片、丹参片等建立其指纹图谱[9,10]，指定参照峰，分析共有峰，从少数指标成分到多个指标成分含量测定，为其批次间差异性及其质量控制提供了参考依据。

2.1.2 在胶囊剂中的应用

对含光敏感、遇热不稳定等成分与含油量高而不易制成片剂的药材可制成胶囊。中药软胶囊生产中易出现成型不好如偏丸、漏油、粘连等现象，2015版《中国药典》主要求其溶出度、释放度、含量均匀度、水分等应符合要求，胶囊内容物质量优劣直接影响胶囊剂的质量。

最初药典中对强肝胶囊的质量标准只有芍药苷的含量测定，后有学者对其主要成分龙胆苦苷、丹参酮ⅡA及甘草酸、再到多指标（龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B）定量测定来衡量其质量标准体系[11-13]，均难以全面衡量其质量，韦辉等[14]建立强肝胶囊的指纹图谱，采用Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在230 nm波长下，以乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱，提取工艺为水煎煮，提取物多为水溶性成分，从图谱得丹参酚酸B的色谱峰降低而丹参素和丹酚酸A的色谱峰在增加，说明可能在提取工艺中成分转化了，应从胶囊的原药材和生产全过程进行监测，生产出更安全有效的胶囊。

另溶出度一直作为软胶囊质量控制指标之一，有学者用HPLC法测定穿心莲软胶囊[15]中指标成分脱水穿心莲内酯的量及其溶出特征，采用Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为甲醇-水，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。其中不同批次指标成分的量及溶出度无明显差异。有学者建立疏郁胶囊、血栓通胶囊血清指纹图谱[16,17]，为研究中药复方入血成分，阐明复方药效成分及作用机制提供依据。

2.1.3 在颗粒剂中的应用

中药配方颗粒剂是饮片及汤剂改革的产物，但中药饮片原有的性状及显微鉴别特征消失后如何进行真伪鉴别、单味中药配方颗粒混合后的配方是否与饮片混合煎煮后的汤剂等效，因此，建立颗粒剂质量控制标准是目前生产研究中的难点与热点。

对六味地黄配方颗粒与传统汤剂中成分进行对比，王杰等[18]采用HPLC法在不同色谱条件下测定两者有效成分（毛蕊花糖苷、马钱苷、尿囊素、茯苓酸、23-乙酰泽泻醇B、丹皮酚）的含量，其中毛蕊花糖苷和尿囊素的量基本一致，配方颗粒中除挥发性成分丹皮酚外，马钱苷、茯苓酸和23-乙酰泽泻醇B的量明显高于传统饮片。从化学成分来说配方颗粒的生产参数基本合理科学，多可替代汤剂使用。

消渴清颗粒（XG）最初质量控制用RP-HPLCELSD法测薯蓣皂苷元的含量，为其提供质量标准[19]。后王露黔等[20]首次用UPLC-PDA-ELSD法[21]建立了XG的指纹图谱，采用Waters Acquity UPLC HSS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），乙腈－醋酸盐缓冲液梯度洗脱，柱温30℃，流速0.2 mL·min-1，进样量3 μL，检测波长为258 nm；ELSD空气体积流量为2.5 L·min-1；漂移管温度为105℃。XG含有皂苷类成分，只用紫外检测器不能完整地评价其质量，而PDA与ELSD联用，对其新芒果苷、芒果苷和知母皂苷BII等多个成分定量测定，其含量差异显示了批间差异性，可对XG的质量做出整体评价。

夏桑菊颗粒由制作工艺的不同分有糖和无糖型，夏伯候等[22]分别建立其HPLC指纹图谱，采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱，流速1.0 mL·min-1，检测波长290 nm，用乙腈-1.0%醋酸梯度洗脱，结合正交最小二乘法判别分析法，得出两种颗粒间差异最大的组分主要有6个，可为夏桑菊颗粒整体质量控制，质量鉴别评价提供一种有效手段。卢君蓉等[23]建立二母颗粒的HPLC-ELSD指纹图谱，将药材、浸膏、颗粒剂的图谱进行对比相似度均大于0.9，可对控制原药材-中间体-成品全过程质量监控的其他制剂提供思路与方法。

2.1.4 在散剂中的应用

散剂可直接作为剂型，也可为其他制剂如颗粒剂、胶囊剂、片剂、喷雾剂、混悬剂和粉雾剂等制备的中间体。故散剂的制备、质量控制技术与要求在其他剂型中具普遍意义。散剂粒度小且比表面积大，易出现潮解结块、变色或霉变等不稳定现象。于霞等[24]建立痹可通散的HPLC指纹图谱，采用Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇－乙腈－0.1%磷酸梯度洗脱，流速 1.0 mL·min-1，检测波长 300 nm，柱温30℃。标定共有峰15个，指认3个，10批样品相似度为0.987-0.991，其专属性、稳定性、重复性和精密度均良好。该法能为痹可通散的全面质量标准研究提供实验依据。

李越峰等[25]首次采用HPLC法，色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），用乙腈－磷酸梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为210 nm、240 nm ，得血清中四逆散冻干粉样品相似度均大于0.99，一次给药5 h后血中产生8个移行成分，为其药效作用机制提供依据。

2.1.5 在丸剂中的应用

丸剂因携带方便，制备简单，在制剂中占重要地位。古代医家对丸剂的规格没有明确标准，常以如小豆、桐子等描述。其服用量与刺激性大、溶散和崩解困难等，对患者特别是小儿口服困难，怎么祛除和掩盖其不良气味及控制其质量是现代丸剂研究的重要内容。

滴丸能提高难溶性药物的生物利用度，但其载药量小，需精制富集有效成分或有效部位，丸重与圆整度是其质量控制的重要指标。大黄硝石汤含酸、碱性药物成分，煎煮中生成难溶性沉淀使有效成分减少，制成滴丸可提高其生物利用度，药雅俊等[26]建立了大黄硝石滴丸的多波长指纹图谱及对其多成分（栀子苷、盐酸小檗碱、西红花苷）进行含量测定，采用Apollo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1 mL·min-1，用乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，10批样品在238、345、440 nm下检测得图谱相似度均大于0.9，批间差异小，滴丸的制备工艺稳定，可有效地对大黄硝石滴丸的质量进行初步控制。

蜜丸生产周期长，含糖量高，易出现菌检超限、变硬等问题。蜜丸的软硬度是检查其质量的重要指标之一。李晗[27]通过HPLC-ELSD法测定大蜜丸中蜂蜜所含果糖、葡萄糖、蔗糖的量，果糖、葡萄糖在蜂蜜中含量不得少于60%，有规定蔗糖含量不得大于5%，果糖与葡萄糖的比例大于1为好，通过控制其糖含量可有效地控制大蜜丸中蜂蜜的质量。

Wang等[28]采用HPLC/qTOF-MS法对26批牛黄上清丸进行检测，均得60个特征成分，与样品3相比，15个样品质量较差，为建立复杂中药制剂的整体质量控制提供思路；Liu等[29]对18批参麦地黄丸建立HPLCELSD法，同时鉴定七种化合物，其中，5-羟甲基糠醛的含量在不同批次间有显著差异，为其建立了全面的质量评价体系。

2.1.6 在栓剂中的应用

栓剂多应用于妇科疾病，如阴道炎等，为使中药安全高效，保证质量，其质量控制标准最初以其性状、鉴别、检查、含量测定等项目检测，用单一指标成分难以全面反映药材的整体特征。

王鹏娇等[30]建立10批百草妇炎清栓的HPLC指纹图谱，采用Comatex C18-AA色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈－0.04%三乙胺缓冲液梯度洗脱，流速1 mL·min-1，检测波长220 nm，柱温30℃。以苦参碱为特征峰，得13个共有峰，批间相似度均大于0.9，表明百草妇炎清栓的质量稳定，该法操作简单及特征性、精密度、重复性均较好，可用于百草妇炎清栓的质量控制。目前，栓剂的品种相对几种常用制剂较少，指纹图谱在栓剂质控方面的研究也相对较少。

2.2 指纹图谱在半固体制剂中的应用

半固体剂型包括煎膏、软膏、凝胶剂等。指纹图谱对该类制剂质量控制的研究可为制剂鉴别、工艺及质量稳定性评价提供参考。《中国药典》中对其质量评价相关参数较单一，难以评价其整体质量。

2.2.1 在煎膏剂中的应用

煎膏浓缩、收膏工艺的质量控制指标一般为相对密度、含水量、动力黏度。2015版《中国药典》中仅对成品不溶物、相对密度及微生物限度等指标作了规定，很难准确保证煎膏质量，也没涉及清膏的相关参数，无法对其质量进行全面控制。

沙棘膏为沙棘成熟果实的水煎膏，去渣浓缩后，为清膏，后加炼蜜或糖制成的半流体制剂，因无相关参数，游佳莉等[31]建立沙棘膏HPLC指纹图谱，色谱柱为Agilent zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.4%磷酸为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，检测波长360 nm。得7个共有峰，除S14样品外，相似度都在0.9以上，有良好的一致性，为沙棘膏的鉴定、工艺研究、全面质量控制奠定基础。

2.2.2 在软膏剂中的应用

中药软膏剂化学成分复杂，一些有效成分尚不明确，及赋形剂的添加，为质量控制增加了难度，从常规标准（外观性状、粘度、PH值、刺激性等）、定性鉴别、定量测定到指纹图谱的发展应用均为其质量控制提供一定帮助。

大部分中药提取有效成分在软膏剂中仅占2%。王艳坤等[32]为烧伤膏建立HPLC法，采用Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），多次预实验确定流动相为甲醇－0.1%磷酸梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。对膏剂指标成分（没食子酸、芦荟大黄素、大黄素和大黄酸）同时测定，不同批次间相似度值均＞0.9，其有效成分含量相差不大，该法为烧伤膏的批间稳定性及质量控制提供可靠依据；另徐彬等[33]对烧伤愈合膏复方与药材均建立指纹图谱，对比谱图，归属特征峰，为烧伤膏的质量控制奠定了基础。

2.3 指纹图谱在液体制剂中的应用

液体制剂包括汤剂、糖浆剂、注射剂等，具吸收快、作用迅速，给药途径广泛等优点，但不易储存与携带，药物易降解霉变。澄清度、稳定性是影响其质量的主要因素。

2.3.1 在注射剂中的应用

中药注射剂在对危重急病的治疗，具药效快、生物利用度高等特点。而由其成分过于复杂、质控标准不严、药物局限性及个体差异的存在引起的不良反应较多，其安全性涉及到研发、生产、贮运、使用等各个环节。通过建立注射液HPLC指纹图谱可评价其稳定性，对其全面质量进行有效控制，加强其使用安全性。

汪悦等[34]对丹红注射液采用HPLC-UV-MS多元指纹图谱，采用Atiantis T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm），0.05%甲酸－50%乙腈梯度洗脱，流速0.9 mL·min-1；柱温25℃，进样量20 μL，UV检测波长：0-75 min，280 nm；75-130 min，326 nm。MS检测采用ESI源，负离子选择离子（SIM）模式；丹参中酚酸类化合物有良好的紫外吸收，质谱有高灵敏度、选择性等特点，联用可得丹参及红花各成分信息，进一步明确注射剂所含成分，为后期哪些成分导致不良反应奠定了基础，用HPLC定量分析方法[35]得9种成分质量浓度有良好线性关系，该法为丹红注射液的质量控制提供研究基础；Wang等[36,37]对参芪扶正注射液建立HPLC指纹图谱及进行动物实验，得主要生物活性成分，黄芩苷与过敏反应有关，汉黄芩苷与毒性有关，为注射液的质量控制及临床研究提供了依据。

2.3.2 在汤剂中的应用

汤剂是中药制剂中历史最悠久、应用最广泛的一种剂型。汤剂的疗效与其煎煮质量密切相关，在煎药过程中应确保中药汤剂的质量。

胡建兰等[38]建立凉膈散汤剂HPLC指纹图谱，采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇－0.1%磷酸梯度洗脱，检测波长235 nm，柱温38℃，流速为1 mL·min-1，进样量10 μL。以黄芩苷作为参照峰，共标记22个共有峰，其8个色谱峰可明确其化学成分，样品批间相似度均大于0.9；该法为其质量研究奠定了物质基础。有学者建立其血清指纹图谱，为中药作用机制奠定基础，黄海艳等[39]建立了补阳还五汤水煎液及血清指纹图谱，采用Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），优选出乙腈－0.05%磷酸作为流动相，DAD在9个波长下全扫描，得检测波长为230 nm，该波长下基线较平稳，峰多，分离度较高，为复方制剂质量控制提供依据；对SD大鼠灌胃，其血中移行成分发生量和质的变化，得30个入血成分，19个为药源性成分，初步推测其为补阳还五汤的药效物质基础成分。

2.4 指纹图谱在其他制剂剂中的应用

指纹图谱在喷雾、气雾剂等也有研究，崔清华等[40]建立了10批舒咽喷雾剂的指纹图谱，采用C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），用甲醇－乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长280 nm。标记11个共有峰，相似度均大于0.9，但发现胖大海中有效成分基本没有保留，为后期优化工艺、有效控制舒咽喷雾剂质量提供了可靠方法。另HPLC指纹图谱在贴剂（如双香贴膏、东乐膏）等其他制剂中也有一些应用，只是相对最常用的几种制剂，其研究较少。

综上，HPLC指纹图谱多用甲醇（乙腈）－0.1%甲酸（磷酸）梯度洗脱，流动相为乙腈时，基线更平稳，分别对提取溶剂（多为甲醇）、提取方式（多为超声）、提取时间、萃取溶剂和萃取次数进行考察，优化色谱条件来得更多的特征峰。而对已知药效的指标成分，可将药效物质群的指纹图谱定性和指标成分的定量研究相结合，加强指纹图谱的特异性表征，应进一步深入研究制剂的血清指纹图谱，建立其谱效关系，为建立现代中药制剂质量标准体系提供依据。HPLC指纹图谱在中药制剂中的应用都是按中药注射剂的要求来开展的。

近年，许多先进设备与分析手段等应用到中药制剂的生产以及质控中，产品的质量有了提高。建立指纹图谱，不仅可以提高原药材、半成品、成品的标准化程度，控制其质量，还可逐渐实现中药现代化。

3 指纹图谱在制剂工艺研究中的应用

很多中药的内在成分尚未研究清楚，工艺研究中以某单一活性成分的含量为指标是难以评价其整体质量的。而中药指纹图谱有多层次、多靶点等特点，可为中药制剂工艺的优化及减少不良反应奠定基础。

王锐等[41]建立指纹图谱，色谱柱为Agilent HC-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），用甲醇－0.25%冰醋酸梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm，对水提工艺中提取压力、容量、工序损失等因素进行单因素对比研究前列安栓水提粉的谱峰含量，已知峰占26个共有峰的61%，含量分析得干燥工序，A工艺，3M3罐更好。该方法为中间产品的质量控制和工艺优化提供了一种新的技术手段；刘海霞等[42]基于多指标分析及HPLC指纹图谱优选了小儿银马口服液的最佳澄清工艺。

张慧等[43]通过对黄瑞香注射液建立药材、半成品以及半成品经酸和碱水解后的HPLC指纹图谱，得工艺中pH的调节对注射液稳定性影响很大，为进一步优化工艺提供了依据；有学者采用正交试验及HPLC法来确定散瘀镇痛颗粒[44]最佳提取工艺。

HPLC指纹图谱为中药制剂优选出最佳提取、干燥、澄清等工艺，为最终制剂的安全、有效奠定基础。

4 小结与展望

中药制剂的质量优劣直接关系到临床上药物使用的安全性与有效性，也关系到用药者的健康与安全，而中药制剂的质量与其原药材、半成品及成品质量密切相关，而中药本身成分的复杂性，找到的特异性指标成分越多，其质量越易控制，而中药制剂的质量控制的源头就是中药材，故必须优化与解决影响中药制剂质量的关键因素，为中药制剂建立严格的质量控制标准。

HPLC指纹图谱是目前中药制剂质量控制最常用的技术，能较全面的反映中药成分间的复杂性和相关性，可监测中药制剂的真伪、优劣、稳定并优化其生产工艺，从整体和全过程实现质量控制。从最初的建立药材单一指纹图谱到从各个层面构建一组指纹图谱，包括TLC、GC、HPLC和HPCE等技术及联用技术等，改变以往单一的质量评价模式，向综合的质量评价模式发展，从而得到更加全面的化学信息。但HPLC指纹图谱也存在缺点，其仅反应中药化学信息，而不能直接体现中药药理活性信息，从而难以评价中药的药效。中药制剂的药效通过各中药中起药效的化合物群发挥作用，各种中药量的多少及比例关系会可导致化合物群的种类和数量发生变化而影响疗效，指纹图谱反映该变化，来开展与药效评估相关的指纹图谱质量控制，将中药指纹图谱中的化学成分变化与药效联系起来建立实际意义的“谱效学”，即罗国安[45]提出对多维多息化学特征谱的研究。但其对中药制剂内在质量的综合疗效关系，即中药指纹图谱对中药制剂药效信息的描述方面的研究尚浅。关于中药制剂完整的“谱”来反映中药整体的“效”，即谱效关系的对应体系还应进一步深入研究。

随着现代技术的发展，指纹图谱及其他分析技术研究将进一步深入，逐步实现中药材、中成药质量标准的现代化。大大推进了现代中药质量标准的研究，对科学全面的评价中药制剂质量具有重要的意义。

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