磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝细胞肝癌病理诊断中的价值及应用

路翔宇，龚 军，许 建，熊 伟，俞小炯(1.电子科技大学医学院，四川 成都 61007；.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆外科，四川 成都 61007)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝细胞肝癌病理诊断中的价值及应用

路翔宇1，2，龚 军2，许 建2，熊 伟2，俞小炯2
(1.电子科技大学医学院，四川 成都 610072；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆外科，四川 成都 610072)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的明确诊断主要依靠组织病理学和临床影像学检查，而鉴别诊断需要免疫组化标记物辅助确诊。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)是一种广泛应用于肝细胞肝癌免疫组化的标记物。随着对GPC-3研究的深入，发现它不仅在血清有表达，同样在肝细胞癌组织中表达。根据GPC-3在肝细胞肝癌及癌旁组织的表达情况，我们更新关于GPC-3在正常和肿瘤组织中的表达的当前知识，评估其在临床实践中作为肿瘤标志物的效用，探讨其作为一种新型癌胚胎蛋白的临床意义，为肝细胞肝癌的诊断提供科学依据，从而为肝细胞肝癌的靶向治疗提供新的方向和依据。

肝细胞肝癌；磷脂酰肌醇蛋白多糖-3；免疫组化；病理

肝癌是最常见的癌症之一，在全世界癌症死亡原因中排列第三。是我国位居第二的癌症“杀手”，其恶性程度高病情进展快[2，3]。近年来，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，其最重要的原因是其发病机制仍不十分明确。在发展中国家慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染约占肝癌发病总数的60%[4]。尽管手术技术和医疗管理的不断更新，HCC患者的长期预后仍不能令人满意[5]。按组织发生可将肝癌分为三大类：①胆管细胞型肝癌：癌细胞起源于肝内胆管上皮。其组织结构多为腺癌或单纯癌，此型比较少见。②混合型肝癌：癌组织中既有肝细胞癌又有胆管细胞癌结构，此型最少见。③肝细胞癌：癌细胞起源于肝实质细胞，此型最常见，约占肝癌的80%～90%。在我国原发性肝癌中肝细胞癌占91.5%，患者早期无明显症状，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期，5年生存率低于10%～95%[6，7]。影像学技术如CT扫描、超声波检测或磁共振成像等是诊断HCC的主要手段，但是影像学检测对微小病灶、良性病变或肝硬化结节等的鉴别准确度不够。因此寻找新的、灵敏度高、特异性强的肿瘤指标一直是研究的热点。近期的国内外研究显示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC-3)在人类HCC组织及血清中有显著的表达，尤其是在AFP阴性的HCC中GPC-3亦有表达。其对原发性肝癌的诊断具有较高的敏感性和特异性，与肝癌关系密切[8，9]。外科手术是治疗肝癌的标准方法之一，患者预后差异很大。检测肝癌组织中的蛋白水平已被广泛报道在预测生物标记物这方面[10]。有研究报道[11]，在肝癌组织中的高表达与预后GPC-3呈正相关，包括总生存期(OS)和转移或无病生存率(DFS)，本文就GPC-3在HCC组织中表达的研究进展作一概述。

1 GPC-3作为肝癌细胞来源的标记物

GPC-3于1996年被Pillia在研究过度生长综合征时从人胚胎中发现[12]。Glypican-3正常表达在胎肝和胎盘中，在成人肝组织中可以忽略不计的正常表达[13]。GPC-3基因位于人X染色体上(Xq26.1)。它的启动子区包括6个SPI结构、7个AP2结构和2个CAAT盒，产生2130 bp的转录子，编码含580个氨基酸残基的GPC-3蛋白质前体。GPC-3核心蛋白相对分子质量约为70 Ku，它富含一段包括14个半胱氨酸残基的独特序列，中间为Furin蛋白酶切位点。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 Ku的N末端亚基和30 Ku的C末端亚基[14]。GPC-3主要通过Wnts信号途径产生作用，GPC-3在正常组织中表达及分布有明显的组织特异性和组织分化的时相特异性其作用机制是在羧基末端接近细胞膜的区域含有两个硫酸乙酰肝素(HS)糖链，可参与调解多条信号通路，与其细胞分泌的多种细胞因子结合，促使肿瘤侵袭和转移[15]。GPC-3表面表达水平在HCC细胞系之间变化，Hep3B具有最高表达之一，每个细胞估计有200000个位点。HuH-7和HuH-1都具有相当少的表面表达，每个细胞约10000个位点。此外，GPC-3具有高内化速率，渴望使其成为免疫毒素靶向的位点[16]。近年来国内外的研究基本上都一致认为GPC-3作为肝癌细胞来源的标记物具有理想肿瘤标志物的特性，对诊断HCC有较高的敏感性和特异性。

2 GPC-3在肝细胞肝癌组织中的表达

GPC-3在组织病理学诊断过程中也可作为辅助工具，使用免疫组织化学和实时逆转录酶聚合酶链反应研究[17]59例直径小于或等于3 cm的肝癌患者，以及66例肝硬化患者和16例低级别发育异常结节患者，33例高级别异型增生结节和13例局灶性结节性增生样结节患者，结果发现小肝癌中GPC-3的表达明显比肝硬化和其他类型的小局灶性病变高，这表明从预恶性病变到小肝癌的转变与GPC-3的表达在大多数情况下急剧增加有关。研究[18]免疫组化结果显示，GPC-3蛋白在85%(34/40)HCC组织高表达，而在正常组织和其他肝病组织中阳性率均为0(0/50)和0(0/7)。近年来研究[19，20]发现，约有56.3%的早期肝癌的肝癌细胞表达GPC-3，显著高于AFP(31.3%)；且GPC-3的表达与肿瘤大小及HCC分期无相关性。由此可见[21]，GPC-3相对于AFP可提高早期HCC诊断率。进一步比较GPC-3在HCC和非肝细胞癌组织的表达方式，结果提示GPC-3在HCC胞质和膜呈强阳性；在分化良好的HCC细胞中，GPC-3阳性也明显高于癌旁组织；而局灶性结节性增生病组织中GPC-3为阴性。比较肝细胞肝癌、胆管细胞型肝癌及胆囊癌组织中GPC-3的表达状况也发现，GPC-3在85%HCC中高度表达，而在胆管细胞型肝癌及胆囊癌中阴性。

杨龙等[22]研究证实GPC-3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达量极低，说明GPC-3和肝癌有特定的关系。GPC-3抑制肿瘤的生长，更加说明GPC-3在肝癌表达的特异性和在肝癌作用机制的特异性；研究表明GPC-3在肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肾癌和卵巢癌组织中表达缺失。相关分析表明[23]，GPC-3在肝细胞肝癌组织中的表达的高低仅与血管浸润相关，与性别、年龄、HBsAg、AFP、肝硬化、TNM分期、肿瘤大小、肿瘤数目以及肿瘤的分化程度无相关性。

3 GPC-3与肝癌患者预后和复发

Jin等研究表明[24]，较低的GPC-3表达导致HCC患者具有低生存期以及增加了外科手术切除肿瘤后复发的风险。Ning等[25]研究表明GPC-3的表达与HCC手术后的转移和复发密切相关。HCC术后GPC-3高表达患者的转移和复发风险是GPC-3低表达患者的3.214倍。生存分析显示，GPC-3高表达的HCC患者的总生存期明显短于GPC-3低表达的HCC患者(P= 0.003)。Shirakawa等[26]对107例接受手术治疗的患者进行5年随访，发现GPC-3阳性组的5年生存率(54.4%)明显低于GPC-3阴性组(87.7%)。16例首选手术治疗的GPC-3阴性患者，在随访期间均没有死亡。Chan等[27]研究表明GPC-3可能参与肝母细胞瘤肿瘤发生，为了从源头上抑制或阻断肝癌的发生发展，很有必要将此问题进行深入研究。这种磷脂酰肌醇通过刺激经典Wnt信号传导促进HCC的体内和体外生长。该信号通路的活化诱导转录因子b-连环蛋白的胞质积累和核易位。在细胞核中，β-连环蛋白与转录因子的LEF/TCF家族的成员结合，并诱导刺激细胞周期进程和细胞存活的基因的表达。多因素分析显示，GPC-3的表达情况是肝癌独立的预后相关因素。如上所述，他们使用不同的百分比阳性肿瘤细胞和不同的阳性区域，可能在临床实践中造成误差。因此，我们认为有必要采取公正、普遍和更有效的分析方法精确和全面分析GPC-3在HCC患者中的预后价值。

4 展望

迄今为止，GPC-3是将HCC与肝脏良性病变和非HCC恶性肝细胞损伤区分开来的最可靠的肿瘤标志物之一。研究表明[28，29]，GPC-3在HCC检测中的敏感度是56.8%到83.4%，与Arg-1、HepPar-1和CD34在HCC患者中的检出率相当。考虑到能够选择从肝组织活检染色HCC的免疫组织化学标记，GPC-3应与染色板结合使用以提高HCC检测的准确性。由于HCC的发生仍是一个长期的、多阶段、多因素导致的复杂过程，且起病比较隐匿。目前临床上对于此类患者多采取外科干预治疗，但由于其预后较差，所以寻找新的治疗方法已经势在必行。

目前，多种抗GPC-3的单克隆抗体已经研制，这些抗体可以在细胞和组织中特异识别GPC-3蛋白，抑制肝癌细胞的增殖或诱导凋亡。GPC-3在HCC中特异性高表达，在非肝细胞肝癌组织内低表达或不表达，其在肝细胞癌的诊断与鉴别诊断方面有重要的临床价值。它的功能的表达和作用作为一个重要的信号调制器提示GPC-3可能是癌症治疗的潜在靶点。根据近期的结果[30]，GC33在患有晚期HCC的受试者中良好耐受，并且达到任何剂量限制性毒性。Feng[31]等分离了第二个潜在靶标，称为HN3，其以高亲和力结合GPC-3。当被引入GPC-3阳性HCC细胞系中时，HN3显着抑制细胞增殖，据推测是通过在G1期诱导细胞周期停滞。在小鼠中，HN3同样减缓了HCC肿瘤生长。这两种抗体都可能在GPC-3相关癌症的未来预测和治疗中发挥作用。目前正在评估由Nobuoka等[32]开发的GPC-3衍生肽疫苗在患有晚期HCC的患者中通常有利的I期和II期结果。预期随后更大规模的随机临床试验将确定该疫苗的功效。动态观察外周血中GPC-3表达水平有助于判断肝癌患者的预后、复发等情况，有望成为判断肝癌复发转移的一个有意义的预测指标。它与AFP相比具有更高的特异性，成人组织中缺乏表达，在确定的光谱中存在GPC-3免疫染色是一种有价值的诊断试验以及将临床肿瘤组织标本进行鉴别诊断。因此，我们乐观地认为，GPC-3可以在肝脏疾病中提供有用的预后和治疗价值，特别是当与肝脏病变的形态学评估结合时。然而，目前大多数研究的局限性都是基于回顾性和横断面设计的研究。前瞻性队列研究将使得未来在进一步研究与探讨GPC-3的结构和功能时，有助于发现新的、更有效的和具有肿瘤抑制活性的抗体，并在此基础上应用多靶点抑制剂或联合不同作用途径和机制的药物，可能在未来肝癌治疗中取得更大的成功，也为开发更加有效的肝癌治疗药物和合理的治疗策略提供理论依据。

[1] Liu JW，Zuo XL，Wang S.Diagnosis accuracy of serum Glypican-3 level in patients with hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis：a meta-analysis[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19(19)：3655-3673.

[2] Teufel A，Marquardt JU，Galle PR.Next generation sequencing of HCC from European and Asian HCC cohorts.Back top 53 and Wnt/beta—catenin[J].J Hepatol，2013，58(3)：622-624.

[3] 杨婉婷，侯恩存，原发性肝癌的研究进展[J].现代肿瘤学，2016，21：3495-3499.

[4] Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61：69-90.

[5] Cai MY，Tong ZT，Zheng F，et al.EZH2 protein：a promising immunomarker for the detection ofhepatocellular carcinomas in liver needle biopsies[J].Gut，2011，60：967-976.

[6] Stefaniuk P，Cianciara J，Wiercinska-Drapalo A.Present and future possibilitiesfor early diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol，2010，16(4)：418-424.

[7] 陈孝平，汪建平.外科学[M].第8版.北京：人民卫生出版社，2013：432.

[8] Gao W，Ho M.The role of glypican-3 in reg ulating Wnt in hepatocellular carcinomas[J].Cancer Rep，2011，1(1)：14-19.

[9] Shirakawa H，Suzuki H，Shimomura M，et al.Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Sci，2009，100(8)：1403-1407.

[10]Chen D，Xing W，Hong J，et al.Thebeta2-adrenergic receptor is a potential prognostic biomarker forhuman hepatocellular carcinoma after curative resection[J].AnnSurg Oncol，2012，19：3556-3565.

[11]Yu MC，Lee YS，Lin SE，et al.Recurrence and poor prognosis following resection of smallhepatitis B-related hepatocellular carcinoma lesions are associated with aberrant tumor expression profiles of glypican-3 andosteopontin[J].Ann Surg Oncol，2012，19(Suppl 3)：S455-463.

[12]Pilia G，Hughes-Benzie RM，MacKenzie A，et al.Mutations in GPC3，a glypican gene，cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J].Nat Genet，1996，12(3)：241-247.

[13]Wang SK，Zynger DL，Hes O，et al.Discoveryand diagnostic value of a novel oncofetal protein：glypican 3[J].Adv Anat Pathol，2014，21：450-460.

[14]HoM，Kim H.Glypican-3：A new target for cancer immunotherapy[J].Eur J Cancer，2011，47：333-338.

[15]Fico A，Mainaa F，Dono R.Fine-tuning of cell signaling by giypicans[J].Cell Mol Life Sci，2011，68：923-929.

[16]Gao W，Tang Z，Zhang YF，et al.Immunotoxin targeting glypican-3regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signaling and protein synthesis[J].Nat Commun，2015，6：6536.

[17]Libbrecht L，Severi T，Cassiman D，et al.Glypican-3 expression distinguishes small hepatocellular carcinomas from cirrhosis，dysplastic nodules，and focal nodularhyperplasia-like nodules[J].Am J Surg Pathol，2006，30(11)：1405-1411.

[18]余娟平，马强，张斌，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用[J].中国科学，2013，43(1)：89-95.

[19]Li B，Liu H，Shang HW，et al.Diagnostic value of glypican-3 in alpha fetoprotein negative hepatocellular carcinoma patients[J].Afr Health Sci，2013，13(3)：703-709.

[20]Tangkijvanich P，Chanmee T，Komtong S，et al.Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepa-tocellular carcinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers[J].J Gastroenterol Hep-atol，2010，25(1)：129-137.

[21]Yao S，Zhang J，Chen H，et al.Diagnostic value of immunohistochemical taining of GP73，GPC3，DCP，CD34，CD31，and reticulin staining in hepatocellularcarcinoma [J].J Histochem Cytochem，2013，61(9)：639-648.

[22]杨龙，刘剑勇.GPC-3与肝癌的研究进展[J].中国癌症防治杂志，2010，2：146-148.

[23]Chenwei P，Xiaodong W，Weilai C，et al.Reevaluation of glypican-3 as a prognostic marker in HCC using X-tile software[J].Med Oncol，2015，32：359.

[24]Jin GZ，Dong H，Yu WL，et al.A novel panelof biomarkers in distinction of small well-differentiated HCCfrom dysplastic nodules and outcome values[J].BMC Cancer，2013，13：161.

[25]Ning S，Bin C，Na H，et al.Glypican-3，a novel prognostic marker of hepatocellular cancer，is related with postoperative metastasis and recurrence in hepatocellular cancer patients[J].Mol Biol Rep，2012，39(1)：351-357.

[26]Shirakawa H，Suzuki H，Shimomura M，et al.Glypican-3 expression is correlated withpoor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Sci，2009，100(8)：1403-1407.

[27]Chan ES，Pawel BR，Corao DA，et al.Immunohistochemicalexpression of glypican-3 in pediatric tumors：an analysis of414 cases[J].Pediatr Dev Pathol，2013，16：272-277.

[28]McKnight R，Nassar A，Cohen C，et al.Arginase-1：a novelimmunohistochemical marker of hepatocellular differentiationin fine needle aspiration cytology[J].Cancer Cytopathol，2012，120：223-229.

[29]Wang F，Jing X，Wang T，et al.Differential diagnostic value ofGPC3-CD34 combined staining in small liver noduleswith diameter less than 3 cm[J].Am J Clin Pathol，2012，137：937-945.

[30]Zhu AX，Gold PJ，El-Khoueiry AB，et al.First-in-man phase Istudy of GC33，a novel recombinant humanized antibodyagainst glypican-3，in patients with advanced hepatocellularcarcinoma[J].Clin Cancer Res，2013，19：920-928.

[31]Feng M，Gao W，Wang R，et al.Therapeutically targetingglypican-3 via a conformation-specific single-domain antibodyin hepatocellular carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110：1083-1091.

[32]Nobuoka D，Yoshikawa T，Sawada Y，et al.Peptide vaccines forhepatocellular carcinoma[J].Hum Vaccin Immunother，2013，9：210-212.

The value and application of Glypican-3 in pathological diagnosis of hepatocellular carcinoma

LUXiang-yu1，2，GONGJun2，XUJian2，XIONGWei2，YUXiao-jiong2
(1.SchoolofMedicine，UniversityofElectronicScienceandTechnology，Chengdu610072，China；2.TheSecondDepartmentofHepatobiliarySurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

YUXiao-jiong

The definitude diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC) is mainly dependent on histopathology and clinical imaging，and the differential diagnosis should be confirmed by immunohistochemical markers.Glypican-3 (GPC-3) is a widely used marker of immunohistochemistry for HCC.With the constant deepening of research on GPC-3，it has been found that GPC-3 is not only presented in serum but also expressed in HCC tissues.According to the expression of GPC-3 in HCC and adjacent tissues，we have updated the current knowledge about the expression of GPC-3 in normal and tumor tissues，evaluated its utility as a tumor marker in clinical practice，and investigated the clinical significance of this new type of cancer embryonic protein.This will provide a scientific basis for the diagnosis of HCC，as well a new direction and basis for targeted therapy of HCC.

Hepatocellular carcinoma；Glypican-3； Immunohistochemisty； Pathology

俞小炯，男，主任医生，硕士生导师。中华医学会外科学分会第十六届委员会委员，中华医学会外科学分会脾学组委员，中国研究型医院学会肝胆胰外科委员会委员，四川省医学会日间手术委员会副主任委员，四川省医师协会外科学分会常委，四川省医学会外科学分会委员。研究方向：肝胆胰脾外科基础与临床。

R735.7

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1672-6170(2017)03-0012-04

2017-03-14)