循环肿瘤DNA检测及相关研究进展

张孝欢，周 玉

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

循环肿瘤DNA检测及相关研究进展

张孝欢1，2，周 玉2

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

组织活检是目前癌症诊断的金标准，也是肿瘤基因分型的一种方法，但由于肿瘤的异质性和疾病的进展，组织活检对肿瘤的进展、预后、治疗和基因分型的监测有一定的局限性，因此需要一种更优化的检测方法。基于血浆循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA，ctDNA)的液体活检对基因突变的筛查具有高敏感性和特异性，可持续动态观测肿瘤的进展。利用ctDNA的检测能准确检测肿瘤的基因突变，有利于肿瘤的早期发现，还能准确判断肿瘤的进展、预后及协助靶向治疗。

ctDNA；肿瘤；生物标志物；检测方法

1 概述

1.1 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 的发展史 1948年科学家们首次发现人体血液中存在着循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)，1997年，研究发现癌症患者的循环游离DNA明显高于正常患者[1]。17年后，人们才发现这些DNA来自肿瘤，并含有肿瘤的标志性突变。最开始，循环DNA的实际应用并不在癌症领域，而是在产前诊断。Lo等[2]推测胎儿DNA能够进入血液，并于1997年向人们成功展示，孕妇血液中携带着男性胎儿的Y染色体。这让无创产前诊断成为可能，是产前诊断的一次革命。癌症研究晚于产前诊断，这是因为肿瘤DNA比胎儿DNA更难检测，而且早期的测序技术还不够准确可靠。近10年，随着第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)的到来，大大提高了ctDNA检测灵敏度和特异性，使得ctDNA检测在临床研究及应用中起到重要的作用[3，4]。同时ctDNA 可以做为动态监测肿瘤的有效工具，目前有关ctDNA在乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤中对于肿瘤辅助诊断和预后监测的相关科研成果已被相继报道[5～8]。

1.2 ctDNA的生物学特点 ctDNA是存在于血浆或血清中的单或双链DNA。早期研究表明 ctDNA具有许多癌症相关的分子特性，如单核苷酸突变、甲基化改变和病毒基因整合入原癌基因激活的肿瘤突变，因此有研究者推测其来源于肿瘤组织。近年来，ctDNA已经逐渐应用到临床领域，但其许多生物学特性仍不清楚。例如，ctDNA片段的大小仍然是不确定的：有些人认为它比cfDNA长[ 9]。但另外一些人持相反态度[10]，Jiang等发现肝癌患者的血浆中都存在极长或极短的核酸分子，短的片段易检测出肿瘤相关拷贝数畸变[11]；Madhavan等报道了乳腺癌患者也存在类似的现象[12]。

ctDNA的来源目前研究报道有三种：①细胞凋亡或坏死的肿瘤细胞；②活的肿瘤细胞；③循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)。有研究表明，cfDNA片段大小约166 bp，类似于那些典型的凋亡细胞释放的cfDNA的长度[13]。在凋亡细胞中的蛋白水解活性异常可以导致 DNA和核小体释放进入血液循环。Roth等发现，在凋亡细胞中相关的蛋白水解活性伴随血液中脱氧核糖核酸水平的升高而发生相应变化[14]。在肿瘤进展过程中，凋亡的肿瘤细胞的蛋白水解酶活性变化使DNA和核小体进入血液[15]。以上这些研究都支持ctDNA可能来自凋亡或坏死的肿瘤细胞。然而，早期癌症患者血浆中也含有ctDNA，因此凋亡或坏死的肿瘤细胞可能不是它唯一的来源。体外研究发现肿瘤细胞可以连续自动地释放脱氧核糖核酸，早期乳腺癌患者可检测到ctDNA，并且ctDNA的数量增加与肿瘤生长相关，进一步支持ctDNA可能来源于活体肿瘤细胞。有研究证明ctDNA和CTC包含相同的基因突变，而血液既包含CTC又包含ctDNA，这说明CTC可能是ctDNA另一个来源。

ctDNA对肿瘤的转移起到重要的作用。1999年Garciía-Olmo等表明从荷瘤鼠得到的血浆可以稳定地改变体外培养的正常细胞，并首次提出了假设：“genometastasis”，转移灶内占主导地位的癌基因来自原发肿瘤，推测其由于易感细胞的转移，到达远处的目标器官，并在血浆中循环[16]。ctDNA在肿瘤的转移中通过摄取凋亡小体或virtosomes在肿瘤细胞与正常细胞间水平移动，导致远处转移。这些数据表明ctDNA与肿瘤的远处转移有密切关系。已有研究报道，ctDNA与肿瘤的脉管侵袭有相关性，当肿瘤患者血管侵袭时血浆中ctDNA具有显著更高的检出率[17]。

2 技术与应用

2.1 ctDNA的分离提取技术 ctDNA在血液中的含量极少，片段很小，提取难度大。目前提取cfDNA最常用的方法主要有传统的酚-氯仿-异戊醇法，磁珠法(SIGMA)、硅胶膜吸附柱法(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen)等。但每种方法都存在它的优缺点。

传统的cfDNA的提取方法是酚-氯仿-异戊醇法，后来在传统的酚-氯仿-异戊醇法的基础上加以改进，在DNA沉淀步骤中配合使用DNA助沉剂，以期使得经过酚-氯仿去除蛋白等污染的DNA分子尽可能多的析出并沉淀。酚-氯仿-异戊醇配合微量DNA助沉剂法比传统的酚-氯仿-异戊醇法可以获得更高的DNA含量及纯度，但是两种方法的DNA纯度未达到1.8～2.0这一理想区间，提示所提取DNA中可能含有蛋白或多糖污染。

磁珠法的主要材料是一种表面包裹有介孔二氧化硅的磁性复合微粒——介孔纳米磁珠，其特点为具有较大的表面积和较强磁分离能力，且制备工艺过程简单，成本相对较低，尤其适合于痕量DNA样品的提取。但这种方法纯度相对较低，这可能是由于磁珠的吸附能力的限制。介孔纳米磁珠理论吸附能力为每1 μl磁珠可吸附10 ng DNA分子，适用于DNA含量极少的样品。

QIAamp试剂盒是目前较公认的cfDNA提取试剂盒。各实验室的提取浓度略有不同。然而所提取cfDNA的纯度值则鲜有报道。杨波应用QIAamp试剂盒提取90例cfDNA测得OD260/OD280介于1.24～1.76，亦未达到1.8～2.0这一理想区间，由此推断，由于cfDNA提取难度较大，即使使用国际公认的试剂盒，同样会存在一定的蛋白或多糖污染，影响其纯度值。但qPCR结果表明，虽然所提取的DNA纯度未达到1.8～2.0这一理想区间，但是仍可有效进行扩增，扩增成功率为100%。

2.2 ctDNA的检测技术 由于ctDNA的量少且片段小，对它的检测造成了很大的阻碍。ctDNA检测技术可分为两个阶段。第一阶段为基于PCR技术的检测技术，如直接测序法(Sanger法)、突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)法、微滴数字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)、BEAMing数字PCR法、COBAS法等。第二阶段为在NGS基础上发展起来的检测方法。

直接测序法：Sanger法是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X射线胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

ARMS法是利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量低至0.1%～1.0%的突变基因；该方法结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。现已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。

数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，是将一个标准的PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。这种方法的优点是可以对ctDNA进行绝对定量，灵敏度可达到单个核酸分子，检测限低至0.001%，但同时也存在只能检测已知的突变位点、通量低的缺点。

BEAMing技术是结合数字PCR与流式技术，利用特异性PCR引物扩增目标突变区，与磁珠(磁珠上固定有特异的PCR引物)混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光，使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。这种方法实现了单分子DNA绝对定量，其劣势是成本高、操作复杂，而且成功率不算太高，因此目前应用并不广泛。

现在对ctDNA的检测方法没有统一的标准，大家都在探索中。Thress等通过检测38例肺癌患者的EGFR敏感突变以及T790M耐药突变，对比分析了4种检测方法(ARMS法、COBAS法、微滴数字PCR法以及BEAMing 数字PCR 法)在组织和血浆ctDNA中的敏感性和特异性。对于EGFR敏感突变，COBAS法、微滴数字PCR法以及BEAMing数字PCR 法敏感性略高(86%～100%)，但三者之间差异不明显；然而，对于T790M 突变，微滴数字PCR法和BEAMing数字PCR法具有更高的敏感性(69%～71%)，明显高于ARMS法(29%)和COBAS 法(41%)；以上结果提示数字化PCR平台具有更好的敏感性。但是，伴随检测敏感性的提高，特异性却下降，微滴数字PCR法和BEAMing法检测EGFR敏感突变的特异性仅为83%和67%，明显低于ARMS 法和COBAS 法(二者均为100%)，因此寻找二者之间的平衡点显得尤为重要。虽然这些基于PCR的方法具有较好的临床可应用性，但主要针对单个或几个基因已知的突变检测。

随着研究的深入，仅检测几个基因变异是不够的，需要建立多基因检测平台，NGS为此提供了机会。NGS 技术的检测限为0.2%～1%，可以在保证敏感性的基础上检测尽可能多的基因变异。在NGS的基础上发展了很多新技术，其中尤为典型的是Newman等开发的一种称为癌症个性化分析深度测序(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq)对ctDNA进行量化。该方法利用定制化的NimbleGen SeqCap EZ Choice Library作为”筛选器”(包含了139个相关基因的521个外显子和13个内含子，共约125 kb)对样本进行靶向捕获后再进行深度测序，也就是用新一代测序仪预选特异性超过97%的预扩增区域进行有针对性的深度测序[15]。CAPP-seq对非小细胞肺癌(NSCLC)的ctDNA检测结果灵敏度高、特异性强且经济可行。用CAPP-seq发现在I期和II～IV期非小细胞肺癌患者中，ctDNA的检出率分别为50%和100%。Couraud等[18]利用NGS技术同时分析了107个血浆标本的多个基因(包括EGFR、ERBB2、K-Ras、BRAF 以及PIK3CA)，与组织标本相比，检测的敏感性为58%(43% ～71%)，特异性为87%(62%～96%)。近期Lebofsky等[19]利用NGS技术检测了27例不同瘤种患者ctDNA 中的46 个基因，涵盖6800个COSMIC热点突变，结果显示，转移灶组织活检出的29 个突变有28 个可以在ctDNA 中检测到。这些结果证明NGS 技术用于ctDNA 多基因突变检测的可行性。

NGS 技术不仅可以用于检测已知基因变异，更重要的是可以进行全基因组范围内的基因变异分析，包括基因突变、重排以及基因组拷贝数变异(copy number variation，CNV)，并可以发现未知的基因变异。然而，这些新技术还是有它的的局限性。首先，NGS相关的检测方法能检出约50%的早期患者，因此敏感性要求进一步提高。此外，成本保持相对较高，限制了其临床应用。幸运的是，第三代测序技术，高通量，测序成本逐渐降低使ctDNA的检测更有希望广泛应用于临床领域[20、21]。

2.3 ctDNA的临床应用

2.3.1 通过肿瘤基因分型来实现精准治疗 基因分型可以分析遗传突变，在癌症治疗过程中具有重要的作用[22，23]。传统的组织活检只能获得局部和静态的肿瘤信息，无法实时反映由于肿瘤异质性和持续进展中不同阶段的基因分型[24]。Dawson等[25]在30例具有点突变或结构变异的晚期乳腺癌患者的治疗过程中动态获取ctDNA进行了深度测序，发现动态监测同一肿瘤患者不同阶段的ctDNA基因突变，根据不同的基因分型针对性地进行靶向治疗和药物疗效监控，可以起到更好的治疗效果[26]。因此，基于ctDNA分析的液体活检可以提高对肿瘤基因分型的分析和靶向治疗水平，对患者制定个性化医疗方案有重要作用，并在精准医学的推动上发挥重要的作用。

2.3.2 疾病监测与治疗评价 多数恶性肿瘤在治疗过程中进展快且易复发。疾病监测与治疗评价对临床医生确定后续治疗方案是很重要的。Bettegowda等已经表明，连续ctDNA 检测可用于评价治疗效果、评估缓解状态和检测复发与进展[27]。ctDNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌症患者的检出率分别为47%，55%、69%及82%，这表明ctDNA水平增加与癌症进展相关。此外，Diehl等发现大多数患者在手术后ctDNA水平有明显的减少或缺如。在本研究中术后检测到ctDNA的患者都复发，而那些没有检测到ctDNA的患者得到缓解[ 3]。Reinert等发现利用ctDNA检测方法比利用常规检测方法随访患者术后肿瘤复发早十个月[28]。这些研究表明ctDNA检测可以快速预测治疗结果，并为临床医生确定下一个治疗方案提供重要参考。

2.3.3 循环肿瘤DNA与耐药的机制 耐药性是癌症治疗失败的主要原因。然而到目前为止，对肿瘤耐药研究的适当方法还没有建立[ 29]。ctDNA检测的低创性和简便等优点为动态监测肿瘤的耐药机制提供了一个可行的方法。Diaz等分析接受EGFR抑制剂治疗的肺癌患者的ctDNA，发现了42个KRAS基因突变。进一步的研究表明，这种方法可比常规方法早5个月检测出与肿瘤进展和耐药相关的标志[ 30，31 ]。肺癌患者接受一二代EGFR抑制剂治疗发生耐药后，我们可以通过血液中的ctDNA来检测不同时期的耐药突变，选择靶向药物。例如，对于非小细胞肺癌患者，AZD9291在发生T790M耐药突变时有很好的抗肿瘤抗性；crizotinib在发生METexon14剪接点突变时有较好的效果。因此，通过ctDNA的液体活检实时监测耐药突变选择靶向药物可以更好地指导个性化用药，减少副作用，减少患者经济负担。

2.3.4 ctDNA检测开启肿瘤预防新时代 目前，基于ctDNA的液体活检是肿瘤早筛和复发检测的新手段，可以根据ctDNA的检测结果为肿瘤的预防提供指导。这是因为癌症漫长的发病过程为预防提供了充足的时间，加上分子癌变的发生是在癌症启动最早阶段，而不是组织学的结果，所以可以把癌症的预防线从原来癌症早期阶段推前到细胞癌变的阶段，这是传统的肿瘤标志物和影像学检测都难以达到的。Diehl等通过研究发现术后和癌症早期检测出ctDNA的人是癌症的高危人群，我们可以根据检查结果对患者采取预防措施[3，32]。因此，分子技术的发展特别是肿瘤分子技术的发展，开启了肿瘤预防的新时代。

2.4 ctDNA的挑战 ①检测方法不统一，缺少标准化流程。从基于PCR的技术到NGS 技术，除了ARMS 法，其他检测方法并未形成标准化的流程。另外，各中心在样本处理以及病例选择、数据分析方面的差异导致结果的重复性欠佳。因此，我们需要进一步标化检测方法，尽可能减少人为因素带来的偏倚。②虽然ctDNA 基因检测的特异性较好，但敏感性却不理想，如果提高敏感性，又可能导致特异性的下降。因此，选择合适的检测方法找到敏感性和特异性之间的平衡点是解决的办法。③利用ctDNA进行NGS的全基因组测序可以进行多基因甚至基因组分析，还可以发现未知的基因变异。但这要求更大量的ctDNA输入量，但势必同时带来更多正常cfDNA的干扰。因此，需要进一步研究如何提高ctDNA纯度。④由于肿瘤异质性的存在，局部组织穿刺标本很难用于基因变异的定量分析，但外周血中的ct-DNA可能反映肿瘤DNA整体水平，因此可以用于基因变异的定量分析。目前用于定量分析的方法很多，但同样是缺乏标准化的流程、缺乏统一的与临床相关的定量数据，缺乏各定量方法间优缺点的比较，因此，基于ct-DNA的定量研究尚处于起步阶段。

总而言之，ctDNA的检测无论展现患者对手术的应答情况、早期风险预测、实时追踪肿瘤进展，还是在肿瘤耐药突变检测，为其寻找有效的癌症疗法或者药物组合等方面都体现了ctDNA的在临床应用的巨大前景。《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。ctDNA作为液体活检的首选已逐渐从科研走向临床。而欧盟批准将ctDNA检测用于吉非替尼的伴随诊断则更是标志着ctDNA临床应用的大规模实现[33]，在此观点上包括美国国立综合癌症网络(NCCN)、欧洲临床肿瘤学会(ESMO)及中国肺癌EGFR基因突变检测专家共识等指南均达到一致意见。但在ctDNA的检测到临床应用仍是一条布满荆棘却充满希望的路，需要我们不懈努力。

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Detection and related advancs in the study of Circulating Tumor DNA

ZHANG Xiao-huan12，ZHOU Yu2

国家自然科学基金资助项目(编号：81400437)

R73-3

B

1672-6170(2017)01-0148-05

2016-01-09；

2016-06-24)