不同原料厌氧发酵及其微生物种群的分析

黄斐

（许昌职业技术学院，河南许昌461000）

不同原料厌氧发酵及其微生物种群的分析

黄斐

（许昌职业技术学院，河南许昌461000）

文章从生物质能源制备的厌氧发酵原理出发，依据厌氧发酵的原理，对猪粪、鸡粪、牛粪及秸秆为原料进行实验，利用DGGE法进行微生物种群结构差异分析，有利于为不同原料制取生物质能源，提高能源产出效率提供科学依据。

厌氧发酵；微生物种群；生物多样性

我国每年产生超过8亿吨的秸秆和38亿吨以上的禽畜粪污，大量的废弃物闲置堆积甚至焚烧，造成环境生物污染，危害人畜健康。利用厌氧发酵原理制取生物质能源沼气将解决这一问题。

1 厌氧发酵的原理

厌氧发酵的过程分为四个阶段：①水解阶段。秸秆、粪便属于有机大分子碳水化合物，难以直接被微生物吸收利用。需要通过微生物分泌胞外酶将大分子水解为溶于水的小分子化合物；②发酵阶段。有机化合物作为电子受体和供体进行生物降解的过程就是发酵。水解后，小分子化合物被发酵类细菌吸收后形成包括挥发性脂肪酸在内的末端产物后,一部分被细菌自身利用，另一部分继续分解转化；③产氢产乙酸阶段。未被发酵类细菌利用末端产物在专性厌氧产氢细菌的作用下，进一步转化生成乙酸类、二氧化碳和氢气；④甲烷化阶段。在分解类产甲烷菌的作用下，将乙酸进行分解，生成二氧化碳和甲烷。另一部分氧化类产甲烷菌对分解产生的二氧化碳进行氧化还原生成甲烷。

2 不同原料厌氧发酵微生物种群的分析

2.1 实验准备

选取本地水稻秸秆，按照厌氧发酵的制备标准进行粉碎备用。分别在禽畜养殖场选取新鲜的鸡粪、牛粪、猪粪，去除杂质放置在实验用冷藏柜进行保存备用。预先培养含有沼气细菌的培养物作为接种物，以提升沼气发酵的启动速度。按照实验原料进行分组，选用CSTR(有效容积5L)在保持温度为35℃±0.5℃的条件下保持总固体浓度为6%，水力停留30天。每日根据物料的性质、结合有机负荷率，在相同时刻按总进料150g，分别控制四组进料量。进料前后分别搅拌20min,并测定甲烷的产量及浓度，在发酵的第3、9、21、27d分别取样于-20℃实验用冷冻柜保存。

2.2 分析方法

DNA采用MP bio土壤基因组DNA提取试剂盒进行提取，根据微量紫外可见分光光度计测量DNA的浓度和纯度。保持蛋白质纯度比A260/A280在1.9±0.1时，继续进行PCR扩增、变性梯度凝胶电泳实验。选择对应细菌V3区域和古菌区域选择518R/341F/109F作为引物。在518R的5’端增加GC夹，用以提升DGGE的分辨效果。通过DGGE后得到的指纹图谱,每一个条带代表某个微生物优势菌群,经测序和序列比对,从而得出此优势菌群的种类。

2.3 实验结果及分析

（1）甲烷产量及甲烷浓度。四种原料的甲烷产量以猪粪的产量最高，牛粪最低。牛粪、猪粪、鸡粪、秸秆的甲烷产量最高峰分别出现在第1、23、24、28天。牛粪的甲烷产量低的主要原因可能与饲养过程中牛服用抗生素有关。而秸秆则是含有大量纤维素、木质素,延缓讲解速度，使得厌氧发酵在第一阶段水解产生限速，进而延缓了整个厌氧发酵周期。当甲烷浓度达到50%及以上时，甲烷化反应占据明显优势。浓度与产量相同，表现出猪粪最高、牛粪最低，浓度与产量基本呈一致变化。

（2）细菌、古菌的DGGE分析。细菌DGGE分析：厌氧发酵初期细菌各微生物的群落比较稳定，实验进行过半时，生物菌群发生了明显的变化，新增了多条条带，前15天表现的优势条带逐渐弱化，颜色变浅。猪粪的图谱在整个过程中表现出稳定的特性，而牛粪的条带从数目、颜色深浅方面均呈弱势。选取11个条带进行切胶克隆，并完成测序和对比。发现含有大量不可培养的细菌种类，如梭菌属、抑杆菌属等，所列的两类菌群在厌氧发酵的第三阶段发挥了重要作用，在秸秆的发酵过程中，厚壁菌门、变形菌门与拟杆菌门为优势种群。根据Shannon-Wiener指数(H)判断细菌菌群的多样性指数，鸡粪细菌多样性指数最高，保持在3.59～3.73。

古菌菌DGGE分析：厌氧发酵的初期，古菌各微生物厌氧发酵群落变化中，鸡粪的周期相似性差异比较明显，猪粪则结构相似。牛粪的各菌群聚在不同分支上，处于不断调整的过程中。选择其中6条条带进行切胶克隆，并完成测序和对比。发现含有包括古菌甲烷鬃菌属、甲烷八叠球菌属等不可培养古菌群。甲烷八叠球菌属属于优势微生物，产生大量的甲烷气体。判断古菌菌群的多样性指数，鸡粪古菌多样性指数最高，可达3.55。

3 结语

对不同原料厌氧发酵所产出的甲烷产量、浓度以及微生物种群多样性进行分析，有利于对甲烷生产进行优化，调整产气效率。根据文章所设计实验，可以看出在甲烷产气的过程中，以鸡粪的菌群多样性最佳，但是猪粪的菌群发展比较稳定，产气数量及浓度最高。

［1］杜婷婷,云斯宁,朱江,等.生物质废弃物厌氧发酵的研究进展［J］.中国沼气，2016，34（2）：46-52.

［2］李海红，巴琦玥，闫志英，等.不同原料厌氧发酵及其微生物种群的研究［J］.中国环境科学，2015，35（5）：1449-1457.

黄斐（1983-），男，河南许昌人，大学本科，助教，主要研究方向：微生物、发酵食品。