成年男性阴囊局部“热压”后精液参数、精子顶体酶活性及表皮生长因子含量的改变

张爱东 张美华 陈峰 仕治达 于建春 邱毅 刘以训

精子发生对温度非常敏感，睾丸局部温度升高能导致睾丸生精功能障碍甚至不育。研究发现，隐睾导致的不育与生精细胞大量凋亡有关［15］，但生精细胞凋亡的机制尚未完全明确。Gou等［6］将食蟹猴每天放置在43℃温水中，对其睾丸局部温浴30 min，连续2天共60 min后，在终止温浴的1个月内，发现精液中精子数比温浴前下降了80%。本文对正常成年男性睾丸局部温浴（热压）后的精液参数、精子顶体酶活性及精液内表皮生长因子（EGF）的改变进行了观察，报告如下。

对象与方法

1对象：选取2012年5月—2015年10月已育成年健康男性志愿者30例。临床试验入选标准为无心血管系统、呼吸系统、泌尿系统及神经系统疾病，无传染病史，需采取避孕措施节育，身体健康、已婚且至少生育有1个子女的男性（32～48岁，有二胎生育指标），志愿接受43℃男性避孕装置避孕试验。填写知情同意书，一式3份，受试者1份，课题组1份，科研科存档1份。

2男性检查：男性第二性征、阴茎、阴囊、精索、输精管、睾丸、附睾等。每次睾丸热压（testis heat treatment，THT）后进行阴囊皮肤、睾丸大小、张力等检查，并询问自愿受试者的性生活情况，有无勃起功能障碍、不射精等发生。本临床试验经过山东省计划生育科学技术研究所医学伦理委员会批准。

3阴囊外部放置恒温加热带（睾丸热压，testis heat treatment，THT）：热压温度 40～43℃，每周 2次，每次30～50 min，连续进行3个月。进入试验前进行3次精液常规检查和1次血生殖激素T、FSH、LH检测，试验期间每月进行2次精液常规检查，T、FSH、LH检测1次，停止THT试验后2周、1个月、2个月、3个月、半年抽血查T、LH、FSH含量及精液常规分析；禁欲3～5 d取精液进行常规检查。

4男用阴囊局部“热压”装置带的研制及实验器材：恒温控制器、定时器及交流电变压装置的设计和研制。变压装置输入电压200～250 V，输出电压为12 V，时间控制器为1～60 min；选择无毒性的化学材料，制作“热压”带，温度控制在43℃左右（425～435℃），安置在特制的内用裤头上。

5精液常规分析及精子低渗肿胀实验（HOS）：精液常规分析每月取平均值进行实验数据统计。THT试验前后进行自身对照。

按照WHO规定的方法进行精液常规分析［7］。

6T、FSH、LH测定：化学发光免疫分析法测定血清生殖内分泌激素T、FSH、LH。常规抽空腹静脉血2 ml，将血样置于37℃水浴箱30 min，待测血液完全凝固后再取出，1 500 rpm／min离心15 min，分离血清，取3000μl血清上机检测。

7精子染色质扩散（SCD）实验：根据文献［89］略加修改。用中草药皂角提取液代替原精子裂解液中的三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸二钠盐（Tris Borate EDTA，TBE）缓冲液，效果相同，且皂角无毒性。（1）精液标本处理：精液标本用磷酸盐缓冲液（pH 68）调至 10×106／ml，37℃孵育；精子混合液滴在琼脂预处理过的载玻片上，4℃放置5 min。（2）精子变性及裂解：标本载玻片浸入008 mol／L的盐酸（HCl）内变性 7 min；然后浸入精子裂解液内（pH 73）20 min。（3）脱水：然后将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。（4）染色：在标本上滴 50 ml（2μg／ml）DAPI染色，立即在荧光显微镜下观察。如用普通光学显微镜观察，需进行瑞氏姬姆萨染色。（5）结果判断：计数500个精子，观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4个等级，大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。小光晕以≤精子头直径1／4为判断标准，中光晕＞精子头直径四分之一而≤精子头直径2／3，大光晕＞精子头直径 2／3。

8精子顶体酶活性检测：按照深圳华康生物医学工程有限公司提供的试剂盒说明书（改良Kennedy法）进行检测。

9精液EGF检测：按照南京建成生物工程研究所［Bioengineering Institute of Nanjing Jiancheng（Nanjing，Jiangsu，China）］提供的试剂盒说明书进行检测。

10统计学处理：采用 SPSS 130统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，p＜005为差异统计学意义。

结果

1THT试验前后阴囊、睾丸改变及性生活情况：每次THT试验后阴囊皮肤轻微发红，无其他损伤，睾丸张力在1个月时无改变，2～3个月时有个别受试者睾丸张力轻微减低，睾丸大小无明显改变。THT试验前后性生活均正常，无改变。

2THT试验前后精子浓度、活动率、正常形态精子、HOS结果：试验1、2、3个月和停止THT试验1个月后的精子浓度、活动率、正常形态精子及正常HOS与THT试验前比较，差异均有统计学意义；停止THT试验2、3个月后的精子浓度、活动率与THT试验前比较，差异均有统计学意义，见表1。THT试验1个月后有1例出现无精子，2个月后精子密度下降到15×106／ml以下 5例（167%，5／30），精子活动率 ＜20%11例（367%，11／30）；3个月后，精子密度下降到 15×106／ml以下 6例（200%，6／30），精子活动率 ＜20%9例（300%，9／30）。停止THT试验1个月后精子密度仍＜15×106／ml 2例（66%，2／30），精子活动率 ＜20%2例（66%，2／30）。停止THT试验2个月后正常形态精子及SCD均恢复到试验前水平，差异均无统计学意义，见表1。停止THT试验2个月和3个月分别有2例和6例受试者失访。

表1 THT试验前、后各项数据比较（x±s）

3THT试验前后血清生殖内分泌激素T、FSH、LH及SCD测定结果：THT试验1个月后精液量、血清LH及FSH较试验前无变化，差异无统计学意义；血清睾酮（T）水平比试验前明显升高，差异有统计学意义。THT试验3个月后精液量、T水平明显低于试验前，LH和FSH高于试验前，差异有统计学意义。停止THT试验3个月后，精液量、T、FSH、LH均恢复到试验前水平。SCD实验显示，试验1个月、2个月和3个月后，精子DNA完整比率较试验前下降明显，停止试验1个月后精子DNA完整比率下降仍然非常明显，差异均有统计学意义；停止试验2、3个月后精子DNA完整比率与试验前无差异，见表1。

4精子顶体酶活性及精液表皮生长因子（EGF）改变：THT试验 1、2、3个月及停试验 1、2个月后精子顶体酶活性比试验前下降，差异有统计学意义；停止试验2个月后上述各项指标又恢复到试验前水平。试验前后EGF含量比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 THT试验前后精子顶体酶活性及表皮生长因子改变（珋x±s）

讨论

精子发生是在比体温低4～5℃的阴囊内完成。隐睾症患者不育，长期处于高温工作环境下的青年男性生育力下降，43℃局部温浴睾丸诱发生精细胞凋亡，精液中精子数下降，提示温度影响精子发生［2］。Guo等［6］建立了两种“热压”动物模型：（1）通过隐睾手术将一侧睾丸移入腹腔，对侧睾丸留在阴囊作为对照。对大鼠和恒河猴的研究结果发现，隐睾后1～5周睾丸内圆形精子和变态精子几乎全部凋亡，而精原细胞不受影响；（2）另一种动物模型就是将睾丸局部浸入43℃温水中每天温浴30 min，每天一次，连续2天。在终止温浴的1个月内，精液中的精子数目比温浴前降低了80%，热激处理后84天，恢复正常的生精过程。热激不仅直接诱发生精细胞凋亡［4］，且也可通过影响支持细胞去分化过程促进生精细胞凋亡。实验证实，这两个过程都是可逆的。本试验显示，THT试验1～3个月后精子数量、活动率、精子正常形态、精子DNA完整率及精子顶体酶活性开始下降，与试验前比较有差异。实验1个月后有1例出现无精子，即马上减低阴囊加热温度，从43℃加05℃度降低到41℃，防止睾丸造成不可逆损伤。精子浓度、活动率和正常形态在试验2个月后开始下降，这可能与人的生精过程有关。因为一个生精周期大约需要70天。控制性和短时的外界温度的升高，对抑制人类睾丸精子产生是一个相对缓慢的过程，可能是机体在环境条件改变的情况下，进行的自身缓慢调节，是适应生理反应和生理阈值的。如果是超高温和硬性损伤，超过了机体生理阈值范围，就可能导致睾丸永久失去生精功能，破坏睾丸的生精过程。因此，从停止THT试验结果可知，精子密度、活动率和精子DNA完整率都能够在停止2个月后（60 d）恢复，说明睾丸实体组织没有受到不可逆性的损害。THT与其他方法（小剂量激素或体外杀精子剂）联合应用，是有其避孕价值的，也为男性参与计划生育提供了一种可行和有效的方法。

研究表明，“热压”不明显影响实验动物体内FSH和 LH变化［2，6］。隐睾手术后外周血睾酮（T）水平从第1天起明显降低，之后一直保持较低水平，这可能与孤儿受体LHR1和LXRs在睾丸中表达异常有关。本研究通过对志愿受试者的试验观察，试验1个月后血清水平明显增高，可能与试验刚开始机体保护性反应有关，实验3个月后，血清T明显下降，LH及FSH水平明显增高，与试验前比较有差异。精浆EGF水平无明显改变，说明THT对睾丸上皮细胞的影响不大。

初步试验证明，睾丸“热压”主要影响早ⅠⅣ和晚ⅫⅩⅣ期生精细胞的凋亡。Guo等［6］对60余只食蟹猴的实验证实，43℃局部温浴睾丸合并长效睾酮埋植对生精细胞凋亡则有叠加效应，处理后到28 d后即可达到避孕目的，到40＋d后达到无精效果。在84 d，抽出睾酮埋植胶囊，到144 d精液中精子数恢复处理前水平。这些发现为设计简单方便的睾丸热压避孕或热压组合长效睾酮男性避孕措施提供了重要的可行的理论基础和科学依据。本研究观察到人THT 1个月、2个月和3个月后，精子正常形态和精子DNA完整率明显下降，说明THT能够对精子形态和精子DNA造成损伤。

睾丸热压试验是为男性参与计划生育提供参考数据，真正用于临床男性避孕还需要与其他避孕方法联合应用以加强避孕效果。但目前能够用于男性避孕节育的方法不多，而控制人口数量仍然是我国计划生育长期的目标。通过睾丸温浴引起精子质量下降达到避孕目的。本文进行了初步临床试验，特别是睾丸温浴后精子DNA、形态及功能等变化，也可能为男性不育的研究提供一些参考数据。睾丸局部温度过高在人类1个月即可出现精子功能、DNA、结构及数量的异常，个别可达无精子状态。因此，不育男性应该引起注意，避免较长时间在高于体温环境下生活或工作。

1 Chen SR，Liu YX．Regulation of spermatogonial stem cell self renewal and spermatocyte meiosis by Sertoli cell signaling．Reproduction，2015，149：159167．

2 刘以训．我国男性避孕研究的发展前景．自然科学进展，2004，14：249255．

3 Zhang CP，Yang JL，Zhang J，et al．Notch signaling is involved in ovarian follicle development by regulating granulosa cell proliferation．Endocrinology，2011，52：24372447．

4 Zhang MH，Shi ZD，Yu JC，et al．Scrotal heat stress causes sperm chromatin damage and cysteinyl aspartate spicific proteinases 3 changes in fertile men，Journal of Assisted Reproduction and Genetics，2015，32：747755．

5 Zhang MH，Zhang AD，Shi ZD，et al．Changes in Levels of Seminal Nitric Oxide Synthase，Macrophage Migration Inhibitory Factor，Sperm DNA Integrity and Caspase3 in Fertile Men after Scrotal Heat Stress PlosOne，2015，29．

6 Guo J，Tao SX，Liu YX．Heat treatment induces liver receptor homolog1 expression in monkey and rat Sertoli cells．Endocrinology，2006，148：12551265．

7 World Health Organisation 2010 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen．5th ed．WHO Press，Prepublication version：3032．

8 Qiu Y，Wang LG，Zhang LH，et al．Sperm chromosomal aneuploidy and DNA integrity of infertile men with anejaculation．JAssist Reprod Genet，2012，29：185194．

9 Qiu Y，Wang LG，Zhang LH，et al．Quality of Sperm Obtained by Penile Vibratory bratory Stimulation and Percutaneous Vasal Sperm Aspiration in Men with Spinal Cord Injury．J Andrology，2012，33：10361046．