核酶阻断IGF-1及IGF-1R表达抑制病理性瘢痕形成的研究

邓忠远， 李孝建， 侯海静， 张 涛

(暨南大学医学院附属广州市红十字会医院烧伤整形科， 广东 广州 510220)

核酶阻断IGF-1及IGF-1R表达抑制病理性瘢痕形成的研究

邓忠远， 李孝建， 侯海静， 张 涛

(暨南大学医学院附属广州市红十字会医院烧伤整形科， 广东 广州 510220)

目的：探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)在瘢痕组织中的表达水平及核酶对其表达的影响作用。方法:选取2015年5月至2016年7月广州红十字会医院烧伤整形科手术切除的18例患者的病理性瘢痕组织(增生瘢痕9例、瘢痕疙瘩9例)，同期收集的20例正常皮肤标本组织，采用苏木精-伊红染色对组织进行观察，采用实时荧光定量PCR技术检测各组织标本的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平，取瘢痕组织成纤维细胞进行细胞培养获得IGF-1及其受体核酶，取第2-4代生长状态良好的对数生长期细胞+核酶继续培养72h后采用实时荧光定量PCR技术检测IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平。结果:正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05)。正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:瘢痕组织中IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平高于正常组织，核酶具有阻断IGF-1 mRNA及其受体mRNA表达的作用，可能在抑制瘢痕的形成中发挥作用。

胰岛素样生长因子受体1； 瘢痕组织； 核 酶

病理性瘢痕是临床增殖性疾病，是一种皮肤结缔组织纤维化疾病，成纤维细胞增生、胶原与基质沉积是其基本特征。临床根据其特征分为增生性瘢痕与瘢痕疙瘩，患者会出现瘙痒、疼痛，病情严重者会出现增生、挛缩、癌变等病症[1]。相关文献指出[2]，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor -1 receptor,IGF-1R)与病理性瘢痕形成有关，是促进瘢痕形成的重要细胞生长因子。核酶是一类具有高度专一内切核酸酶活性的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，促进mRNA的降解，降低IGF-1及其受体IGF-1R的表达。本研究分别对我院收治的9例增生瘢痕患者、9例瘢痕疙瘩患者与20例正常皮肤标本组织实施实时荧光定量PCR技术检测IGF-1及其受体IGF-1R水平，为临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料:纳入标准[3]：①瘢痕的诊断标准：高出正常皮肤0.3～1.2cm、充血明显、质地硬、触摸无弹性、有瘙痒感、表皮完整；②患者近三个月为接受抗瘢痕药物治疗；③正常皮肤组织来源于外伤患者手术时取材的正常皮肤组织。排除标准：①合并瘢痕破损、溃疡、炎症的患者；②已经局部接受药物、放射等方式进行治疗的患者；③瘢痕出现明显萎缩的患者；④发生恶性变的患者；⑤合并严重的心肝肾疾病、糖尿病及结缔组织疾病的患者。选取2015年5月至2016年7月广州红十字会医院烧伤整形科手术切除的18例患者的病理性瘢痕组织(增生瘢痕9例、瘢痕疙瘩9例)，同期收集的20例正常皮肤标本组织(正常皮肤)。瘢痕组织患者18例，男性12例、女性6例，年龄19～62岁，平均年龄(37.84±11.98)岁，其中增生性瘢痕患者9例，均来自于烧伤创面愈合后6个月的四肢及颈部增生性瘢痕；瘢痕疙瘩取自9例烧伤后患者耳垂部位的瘢痕疙瘩。正常皮肤组织20例，男性14例、女性6例，年龄23～58岁，平均年龄(39.37±9.84)岁。两组标本取材对象的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有较好的均衡性。

1.2 实验指标检测:所有收集的增生瘢痕、瘢痕疙瘩、正常皮肤标本组织，常规送病理切片检查，剩余组织经生理盐水冲洗后，放置于含有20%胎牛血清与10%二甲基亚砜的缓冲液，经过碾磨、碎取、孵育、沉淀、离心操作获得DNA，于-80℃的低温保存待检。采用苏木精-伊红染色对组织进行观察，采用实时荧光定量PCR技术经过引物探针设计合成、组织总RNA提取、逆转录反应、荧光定量PCR反应程序检测IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平。取瘢痕组织成纤维细胞进行细胞培养获得IGF-1及其受体核酶，取第2-4代生长状态良好的对数生长期细胞+核酶继续培养72h，后采用实时荧光定量PCR技术检测IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平。其试剂盒来源于日本TaKaRa公司，仪器为7500全自动荧光定量PCR仪，购于美国ABI公司。

1.3 观察指标:采用苏木精-伊红染色对组织进行观察，采用实时荧光定量PCR技术检测各组织标本的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平，培养72h后采用实时荧光定量PCR技术检测IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平。

2 结 果

2.1 苏木精-伊红染色结果:取正常皮肤组织及瘢痕皮肤组织，经苏木精-伊红染色在40倍显微镜下观察，可以发现正常皮肤组织的纤维细胞、胶原排列疏松(图1)；瘢痕组织可见胶原排列紧密且杂乱、呈旋涡状(图2)。

2.2 不同标本组织中IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异:正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05);见表1。

表1 不同标本组织中IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异(±s,OD值)

注：*与正常皮肤比较P<0.05，#与增生性瘢痕组织比较P<0.05

图1

图2

图3 不同标本组织中IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平

图4 培养72h后IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平

表2 瘢痕组织培养72h后IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异(±s,OD值)

注：*与正常皮肤比较P<0.05，#与增生性瘢痕组织比较P<0.05

2.3 瘢痕组织加核酶培养72h后IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异:瘢痕组织添加核酶培养72h后，正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.4 瘢痕组织加核酶培养72h后与培养前IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异:增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平较培养前均降低且差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 瘢痕组织培养前后IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异(±s,OD值)

3 讨 论

瘢痕是患者机体遭受创伤后细胞增殖的产物，纤维细胞过度增生、胶原与基质过度沉积则会形成病理性瘢痕，在病理角度上将其分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[4]。前者是指患者皮肤创伤后，在愈合过程中纤维结缔组织增生异常的增值性瘢痕组织，大量成纤维细胞增生、细胞外基质中胶原与蛋白多糖的过度沉积是其组织学特征。该病变位置可位于全身任意部位，过量的胶原沉积突出皮肤，但不侵入正常皮肤组织[5]。瘢痕疙瘩是一种良性皮肤肿瘤，其组织学特征与前者相似，但肿块会超出原损伤部位，并持续生长，常发于患者的前胸、肩膀、耳垂部位[6]。目前临床治疗瘢痕的方法有药物、手术、物理康复疗法等多种措施，但治疗后存在瘢痕复发、疗效不确切等特征，其原因为瘢痕发病机制尚未明确[7]。相关文献指出[8]，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子受体-1R(IGF-1R)与病理性瘢痕形成有关，是促进瘢痕形成的重要细胞生长因子。故此，本研究使用分子生物学技术在基因水平阻断IGF-1 及IGF-1R 的表达，抑制瘢痕的过度增生，为病理性瘢痕的防治提供一种新的途径。

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,简称IGFs)是一中具有促进细胞分化、分裂及机体生长发育等多种生物功能的细胞因子家族，IGF-ⅠIGF-Ⅱ是其重要的成员，属于多功能细胞增殖调控因子，与肿瘤的发生、发展具有密切联系。IGF-I为多肽类生长因子，在诸多组织细胞的增殖分裂和分化过程中发挥明显的促进作用，且调控肿瘤细胞的生长分化。IGF-I在机体血清和组织中浓度过高时会促使正常细胞活性的改变，表现为失控性增殖分裂、缺乏分化且细胞死亡明显减少，最终形成病变，出现瘢痕。 IGF-Ⅱ是一种酸性较弱的单链多态，由IGF-I编码，由肿瘤自身组织分泌，无论体内外它对细胞分裂、增殖的促进作用都十分强效，明显强于IFG-I。肿瘤的侵袭、转移过程中离不开IGF-Ⅱ的生物学作用。另外，IGF-Ⅱ对血管内皮细胞的增殖具有明显的促进作用，并在内皮细胞化学趋化过程中发生重要作用。本研究中，正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平具有较大差异性，组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点。这表明了，IGF-1及其受体IGF-1R在瘢痕组织中具有较高的表达，参与了瘢痕组织病理性病变，其浓度水平升高是瘢痕病变的危险信号，且与瘢痕病情具有正相关性。

核酶是一类具有酶活性的RNA分子，能够催化磷酸二酯键水解与形成。在肿瘤治疗方面，核酶具有裂解癌基因作用，针对肿瘤基因设计特异性核酶，并将其引入细胞，阻断其基因在细胞内的表达，抑制病原增殖与肿瘤扩散。核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击，在切断mRNA后，能够从杂交链上解脱下来重新结合和切割其它的mRNA分子。本研究还发现，瘢痕组织添加核酶培养72h后，组间IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平为，正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织。这提示了，核酶能够有效抑制IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平，阻碍瘢痕成纤维细胞增殖。因此，我们认为，临床应用针对IGF-1和IGF-1R基因的核酶降低病理性瘢痕增生过程中的过分表达IGF-1和IGF-1R或阻断IGF-1和IGF-1R生物学作用，能够抑制瘢痕的形成，不影响愈合，且利于预防与治疗瘢痕增生。

[1] 席文群,成洪波,张国明,等.慢病毒介导的RNA干扰技术在滤过术后抗瘢痕的研究[J].眼科新进展,2013,33(5):489～492.

[2] 粱茶,朱斌,唐冰,等.胰岛素样生长因子1在病理性瘢痕中的表达[J].中国现代医生,2012,50(21):24～25.

[3] 刘爱东,王玥,庞久玲,等.基质金属蛋白酶7和转化生长因子β1在病理性瘢痕中的表达:与正常瘢痕及正常皮肤组织比较[J].中国组织工程研究,2012,16(7):1165～1168.

[4] 刘杜鹃,张可佳,丁玉红,等.病理性瘢痕综合治疗的研究进展[J].中国老年学杂志,2013,33(7):1731～1733.

[5] 胡成久,郭瑞珍,王燕.皮肤病理性瘢痕和瘢痕癌中Ras基因家族12/13位密码子突变的检测[J].实用医学杂志,2012,28(4):576～578.

[6] 付晋凤,谭加.病理性瘢痕的发生机制与修复[J].中华损伤与修复杂志(电子版),2013,8(4):6～12.

[7] Saber H, Himali J J, Beiser A, et al. 【Abstract】 T P130: High Serum Insulin-Like Growth Factor 1 is Associated with Lower Risk of Ischemic Stroke: The Framingham Heart Study[J].Stroke, 2015, 46(1):～130.

[8] 蔡浩, 唐冰,朱家源,等.病理性瘢痕中胰岛素样生长因子1及受体mRNA的表达[J].中国组织工程研究,2012,16(46):8629～8635.

Effect of Ribozyme on Blockade of IGF-1 and IGF-1R Expression as Well as Inhibition of Scar Formation

DENGZhongyuan,LIXiaojian,HOUHaijing,etal

(GuangzhouRedCrossHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,GuangdongGuangzhou510220,China)

Objective: To discuss insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1) and its receptor (IGF-1R) expression in scar tissue and the effect of ribozyme on the expression level. Methods: 18 cases of Pathological scar tissue from operation excision (9 cases of scar keloid, 9 cases of scar hyperplasia ) were selected in Department of Burn and Plastics, Guangzhou Red Cross Hospital from 2015 May to 2016 July, meanwhile 20 cases of normal skin tissue specimens were collected. The expression level of tissue was observed by using hematoxylin eosin staining, the expression level of IGF-1 mRNA in each tissue specimen and its receptor mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR, scar tissue fibroblasts were derived to culture cells to obtained IGF-1 and its receptor ribozyme, the cells in the logarithmic growth phase with good growth state in 2-4 generation + ribozyme were selected to culture,72h later, the expression level of IGF-1 mRNA and its receptor mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR. Results: The differences were statistically significant in the expression level of IGF-1 mRNA in normal skin, hypertrophic scar and keloid tissue and its receptor mRNA (P <0.05), the comparison between groups showed that normal skin hypertrophic scar tissue < hypertrophic scar tissue < scar keloid tissue and the differences were statistically significant (P <0.05).Conclusion: The expression level of IGF-1 mRNA in scar tissue and its receptor mRNA are significantly higher than those in normal tissues, ribozyme has the effect on blockade of IGF-1 mRNA and its receptor mRNA expression, which may play a role in inhibiting scar formation.

Insulin like growth factor receptor 1; Scar; Ribozyme

广东省医学科学技术研究基金项目,(编号：A2015069)

1006-6233(2017)02-0228-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.016