3种复方中药含药血清对NCI—H460细胞抑制作用的研究

廖遥灵　王柳萍　韦云妮　杨斌

【摘要】 目的：观察3种复方中药含药血清对体外培养的NCI-H460细胞的抑制作用。方法：选用健康成熟SD大鼠，将大鼠随机分为5组，分别为空白组、A复方组、B复方组、C复方组、环磷酰胺组，给药后分离血清，56 ℃灭活30 min，用MTT法检测含药血清在24、48 h时对细胞的抑制作用。结果：24、48 h，三种复方中药含药血清的5%、10%、20%、30%浓度对NCI-H460细胞均有不同程度的抑制作用（P<0.01），尤以B复方组对NCI-H460细胞作用明显，并呈一定的剂量依赖性。结论：3种复方中药含药血清对体外培养的NCI-H460细胞具有明显的抑制作用。

【关键词】 复方中药； NCI-H460细胞； 血清药理学

随着环境污染的增加及人们各种不良的生活习惯，癌症的发病率正在不断上升[1]。癌症是一大类恶性肿瘤的统称，是目前严重危害人类健康的一大顽症，严重威胁着人类的生活质量，被称为人类健康的第一杀手[2]。肺癌属于中医学肺积、咳嗽、咯血、胸痛等范畴，一般认为肺癌的发生是由于人体正气不足，阴阳气血失调，使脏腑经络的功能发生障碍，机体抗病能力降低，邪气乘虚而入，滞留于肺，日久形成肿块而成肺癌[3]。目前，癌症的预防和治疗方法已经有很多，虽然疗效显著，但是毒副作用大的问题使很多药的临床应用受到了限制[4]。中草药以其毒副作用小、不易产生耐药性的优点在肿瘤治疗领域越来越受重视。中草药复方、单味药提取物或一些单体成分可抑制脂质过氧化反应、清除活性氧自由基、提高机体抗氧化酶活力[5-6]，从而抑制癌症。近年来，中草药在抗癌方面取得了很大的成就，其机制是非常复杂的，不能简单的用现代医学的某个观点来概括说明[7]。中医药对肿瘤治疗的主要理论基础是扶正、固本、驱邪，目前的研究主要集中于单味药的研究，多为体外试验[8]。本研究采用了夏枯草、胆南星、玄参、龙血竭、冰糖草等8种中草药，共有3个复方，各复方中草药的配伍组成和含量不同，A复方由8种中草药组成，B复方由其中4种中草药配伍组成，C复方由其中2种中草药配伍组成。夏枯草为唇形科夏枯草属植物，主要含有三萜及其苷类 苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等[9]，味辛、苦，性寒，有降糖、降压、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤及活血化瘀等功效[10]。胆南星为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成，在临床上用于痰热咳嗽，咳痰黄稠，中风痰迷，癫狂惊痫等症[11]。玄参为玄参科植物玄参的干燥块根，是常用的传统中药；其味甘、苦、咸、性微寒，具凉血滋阴、泻火解毒的功效[12]，现临床主要用于热病烦渴、发斑、齿龈炎、扁桃体炎、急性淋巴结炎等[13]。龙血竭又名麒麟竭，为传统名贵中药，国产龙血竭的化学成分有黄酮、苷类、酚类、糖类等化合物[14]，龙血竭不溶于水，具有抗炎、止痛的作用，能抑制毛细血管的通透性，减少渗出，明显抑制肿胀、缩短凝血时间，促进创面愈合，有效改善机体的免疫功能[15]。冰糖草为玄参科植物野甘草的全草，是壮族地区常用的一味壮药，其味甜，性凉，具有清热毒、除湿毒、通气道和水道的功效[16]，主治感冒发热，肺热咳嗽，咽喉肿痛，肠炎，痢疾，脚气水肿等[17]。我国现有中药材资源12 807种，是世界上最大的药材生产国。以传统中草药的理论和数千年临床实践为基础，结合现代药学理论和技术，严格进行药学、药效学与临床研究，抗癌中草药的开发和临床应用将有新的更大进展[18]。本课题采用血清药理学联合MTT法，研究3种复方中药对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460细胞的体外抑制作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株 健康成年的SD大鼠（200±20）g，SPF级，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002，实验动物使用许可证号：SCXK桂2014-0004。人大细胞肺癌细胞NCI-H460购于中国科学院上海细胞库。

1.2 实验药物 由夏枯草、胆南星、玄参、龙血竭、冰糖草等8种中草药按不同比例组成，由北海博铧医院提供。注射用环磷酰胺，0.2 g/mL，百特医疗用品贸易有限公司，批号：5F063A。

1.3 实验器材 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、台式离心机、酶标仪、电子天平、恒温水浴锅、高压灭菌器、-80 ℃低温冰箱。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清制备实验

1.4.1.1 3种复方中药的制备 称取夏枯草、胆南星、玄参、龙血竭、冰糖草等8种中草药按不同比例用纯净水提取，A复方，由以上8种中草药组成；B复方由以上中草药中的4种组成；C复方由以上中草药中的2种组成，浓缩药液浓度至0.1 g/mL，置冰箱4 ℃保存备用。

1.4.1.2 注射用环磷酰胺的制备 环磷酰胺治疗肝癌的成人日用量为4 mg/kg，每日或隔日1次。根据人和动物间每公斤体重折算系数表，换算出大鼠的剂量为成人用量的6倍左右（即25 mg/kg）。

1.4.1.3 含药血清的制备 SPF健康成年的SD大鼠15只，随机分为5组，即空白组、A复方组、B复方组、C复方组和环磷酰胺组，每组3只。给药前禁食不禁水12 h，空白组灌胃等量的生理盐水，A复方组、B复方组和C复方组分别以2000 mg/kg灌胃，环磷酰胺组以25 mg/kg腹腔注射。2次/d，

间隔12 h，连续给药3 d。末次给药后1 h腹主动脉取血，取血后室温下静置4 h，3000 r/min离心

15 min，分离血清，经56 ℃水浴灭活30 min后，0.22 ?m微孔滤膜过滤除菌，混合分装于2 mL EP管中，置-20 ℃保存备用。

1.4.2 体外抑瘤实验（MTT法）

1.4.2.1 细胞培养 从-80 ℃低温冰箱中取出人大细胞肺癌NCI-H460细胞，迅速放于37 ℃水浴锅中，并来回晃动使其在1 min内完全融化。在超净台中取出细胞转移至15 mL离心管内，在1000 r/min离心5 min，弃去上层液体，将人大细胞肺癌NCI-H460细胞置于含有10%胎牛血清及双抗的RPMI 1640培养液中培养，将培养瓶置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内培养，待细胞养至覆盖培养瓶瓶底80%～90%，用0.25%胰蛋白酶（1%胰酶∶0.2%EDTA=1∶3）進行消化，当细胞处于对数生长期后进行实验。

1.4.2.2 MTT法检测 用不含血清的培养基将含药血清稀释成5%、10%、20%、30%的浓度。取对数生长期的细胞株NCI-H460细胞，用胰酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度至5×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔0.1 mL细胞悬液，板周边的孔不加细胞，留空白调零，即只加培养液不加细胞，将培养板置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内培养24 h。贴壁后吸出原培养液，分别加入空白组、依癌胶囊组和环磷酰胺组各个浓度的含药血清培养液，每组设5个复孔，继续培养24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 ?L，37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内培养4 h后，吸出原培养液，加入150 μL的二甲基亚砜（DM-SO），振荡10 min，在酶标仪上于510 nm处测定每孔的吸光度（OD值），重复测3次。计算药物对细胞的抑制率：抑制率（IR）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在所选的浓度范围内，3种复方中药含药血清对体外培养的NCI-H460细胞均有明显的抑制作用，其中B复方组对NCI-H460细胞的抑制效果要较对A复方组和C复方组更显著。24 h时，5%、10%、30%浓度的含药血清对NCI-H460细胞抑制率：B复方组>环磷酰胺组>A复方组>C复方组；20%浓度的含药血清对NCI-H460细胞抑制率：B复方组>环磷酰胺组>C复方组>A复方组。48 h，5%、10%、20%、30%浓度的含药血清对NCI-H460细胞抑制率：B复方组>环磷酰胺组>A复方组>C复方组。A复方组、B复方组、C复方组各浓度的含药血清与空白组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。3种复方中药含药血清对体外培养的NCI-H460细胞的抑制作用影响，见表1。

3 讨论

肺癌是一种比较常见的恶性肿瘤，近年来，世界各国肺癌的发病率和死亡率均有明显增高的趋势[19]。中草药治疗恶性肿瘤以其毒副作用小的优点广为大家接受，中药及其复方制剂能够通过多种不同途径、多种方法应用于抗肿瘤临床治疗中，发挥独特作用，尽可能避免正常细胞受到损伤，药物毒副作用很小[20]。随着中医中药在国际社会受重视的程度越来越高，中药治疗肿瘤将成为癌症治疗的一种重要途径[21]。夏枯草、胆南星、玄参、龙血竭、冰糖草等8种中草药均为我国传统的中药材，在杀灭肿瘤细胞和缓解症状体征方面有明显效果。

本课题采用血清药理学联合MTT法，研究

3种复方中药对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460细胞的体外抑制作用。结果显示，在所选的浓度范围内，3种复方中药含药血清对体外培养的NCI-H460细胞均有明显的抑制作用，差异均有统计学意义（P<0.01），其中B复方组对NCI-H460细胞的抑制效果要较对A复方组和C复方组更显著。本课题组通过对3种复方中药含药血清的抑癌作用进行研究，为该药进行下一步更深层次的优选配伍研究提供理论和实验依据。

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（收稿日期：2017-01-10） （本文編辑：程旭然）