冬凌草甲素通过下调NF-κB/COX-2表达抑制结肠癌LoVo细胞增殖

刘 娜，李文强，高成伟

(武汉大学人民医院急诊科，武汉 430060；*通讯作者，E-mail:wenqiang67@sohu.com；#共同通讯作者，E-mail:gaochengweihubei@163.com)

冬凌草甲素通过下调NF-κB/COX-2表达抑制结肠癌LoVo细胞增殖

刘 娜，李文强*，高成伟#

(武汉大学人民医院急诊科，武汉 430060；*通讯作者，E-mail:wenqiang67@sohu.com；#共同通讯作者，E-mail:gaochengweihubei@163.com)

目的 观察天然植物冬凌草提取物冬凌草甲素对结肠癌LoVo细胞增殖、凋亡的作用，并分析其可能的作用机制。 方法 体外培养LoVo细胞，用不同浓度冬凌草甲素(0-240 μmol/L)分别处理24，48，72 h，MTT法检测细胞活力的改变。冬凌草甲素(终浓度为0，30，60，120 μmol/L)分别处理LoVo细胞48 h，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，ELISA法检测细胞上清液中PGE2的含量；Western blot检测细胞蛋白环氧合酶-2(COX-2)、p-NF-κB(p65)、Bcl-2及Bax的表达的改变。 结果 冬凌草甲素(15-240 μmol/L)能显著抑制LoVo细胞活力(P<0.05)，呈剂量、时间依赖性。冬凌草甲素(终浓度为0,30，60，120 μmol/L)处理LoVo细胞48 h后，细胞凋亡率分别为8.83%,15.5%，22.64%和25.86%；冬凌草甲素处理LoVo细胞48 h后，细胞Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)，同时p-NF-κB(p65)、COX-2蛋白的表达及PGE2合成降低(P<0.05)。 结论 冬凌草甲素可通过抑制p-NF-κB、COX-2表达及PGE2合成，继而上调促凋亡蛋白Bax表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制LoVo细胞增殖并诱导细胞凋亡。

冬凌草甲素； LoVo细胞； 细胞凋亡； 环氧合酶-2； 前列腺素E2

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率居恶性肿瘤的第3位，死亡率则高居恶性肿瘤相关死亡的第2位[1]；每年全球有超过120万新增病例，有超过60万病例死亡[2]。治疗大肠癌的有效性取决于能否早期诊断，其治疗措施包括手术切除、放疗或化疗等各种组合的综合治疗。不幸的是，在大肠癌的早期阶段，其发病隐匿，即使早期有症状，因其非特异性也未引起患者重视，导致早期诊断困难。事实上，大多数大肠癌患者就医时都已经属于中晚期。化疗仍是进展期大肠癌的主要治疗方式，然而常规化疗药物毒副作用大，易耐药。因此，迫切需要寻找新的治疗方法和策略。

冬凌草甲素(oridonin)，又称延命草宁，是从冬凌草中提取的以贝壳杉烯(ent-kaurene)为骨架的四环二萜类化合物，是冬凌草中最主要的活性成分。前期研究已经证实，其具有抗炎、抗氧化、调解免疫、抗菌等多种药理活性[3]。近年来，大量资料证实，冬凌草甲素也具有抗肿瘤活性，对食管癌、膀胱癌及肺癌等多种肿瘤细胞的均有抑制作用[4-7]。本研究拟观察冬凌草甲素对结肠癌细胞系LoVo细胞增殖、凋亡的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

结肠癌LoVo细胞由中国科学院上海细胞库提供；冬凌草甲素购自上海诗丹德生物技术有限公司(纯度>98%)，用DMSO 配制成10 mmol/L(DMSO的终浓度小于0.1%)的母液，-20 ℃保存；胎牛血清购自GBICO；培养板购于Corning公司；PGE2 ELISA试剂盒购自美国BPB公司；Bax、Bcl-2、COX-2、p-NF-κB(p65)及β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司。RPMI1640培养液、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术研究所。

1.2 主要仪器

台式低温离心机购自日本Hitachi公司；微量精密移液器购自德国Eppendorf公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司；正置荧光显微镜购自日本Olympus公司；电子分析天平购自上海精密仪器仪表有限公司；普通冰箱购自海尔集团；超低温冰箱购自美国ThermoForma公司；脱色摇床购自金坛市正基仪器有限公司；ZP-200恒温振荡器购自常州国华电器有限公司；手提压力式蒸汽灭菌器购自上海华线医用核子仪器有限公司；电热恒温干燥箱购自天津泰斯特仪器有限公司；自动三重纯水蒸馏器购自上海亚荣生化仪器厂；流式细胞仪购自美国Berkman公司；超净工作台(SW-CJ-IFD型)购自苏州真田洁净设备有限公司。

1.3 细胞培养及分组

用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基，于37 ℃，5% CO2条件细胞培养箱中培养LoVo细胞，取生长状态良好的并处于对数期的细胞进行实验。实验分为4组：对照组(0 μmol/L冬凌草甲素)、30 μmol/L冬凌草甲素组、60 μmol/L冬凌草甲素组和120 μmol/L冬凌草甲素组。

1.4 细胞活力测定

取3块96孔板，同时准备好细胞计数板；取对数生长期的细胞备用；调整细胞浓度为5×104/ml，每组设3个复孔，每孔加培养基150 μl，铺板过程中确保每个孔接种的细胞数目一致，铺板完成后将培养板放培养箱中继续孵育；细胞贴壁后各组分别加入冬凌草甲素终浓度为0,15,30，60，120,240 μmol/L的培养液，3块培养板分别培养24，48，72 h，在培养终止前4 h，每孔内加入10 μl 5 mg/ml的MTT，继续孵育4 h后，弃去培养液，每孔加入100 μl的DMSO终止反应。将96孔板置于振荡器上振荡10 min后，在酶标仪上检测490 nm的A值。细胞活力(%)计算公式：(实验组平均A值-调零孔A值)/(对照组平均A值-调零孔A值)]×100%。

1.5 细胞凋亡率检测

取对数生长期细胞，接种于6孔板中，贴壁后弃上清。冬凌草甲素组分别加入含不同浓度冬凌草甲素(终浓度为30，60，120 μmol/L)的培养液，对照组加入含10%胎牛血清的培养基，将6孔板置于培养箱中，培养48 h，收集培养上清于5 ml离心管中，用D-Hanks液洗涤细胞1次，胰酶消化细胞，收集细胞于同一5 ml离心管中。4 ℃条件下1 500 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞。用1×的binding buffer液洗涤细胞，4 ℃条件下1 500 r/min，离心5 min，收集细胞，加入staining buffer液，充分混匀，重悬细胞，调整细胞密度为5×106cell/ml。取5 μl annexin V-APC加入100 μl细胞悬液进行染色，室温下避光放置10 min，将染色后的细胞悬液用流式细胞仪检测，每组设3个复孔。

1.6 ELISA法检测PGE2

按照预定分组处理48 h后，吸取培养基离心后将上清液移至高压消毒的EP管中备用。加入标准品至酶标板中，设置梯度，分别取各组上清液样品100 μl，加入至酶标板中，再分别将每孔加入酶标液50 μl，室温放置90 min。具体操作步骤根据试剂盒要求进行，根据标准品曲线计算样品中PGE2浓度。

1.7 Western blot检测COX-2及p-NF-κB(p65)蛋白表达

消化离心收集各组处理48 h后的细胞，预冷PBS液洗涤，加入预冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃裂解30 min，置于冰上超声裂解；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，移至高压消毒过的EP管中，分装后于-80 ℃储存。采用BCA法测定蛋白质；取40 μg样品并加入等体积上样缓冲液，SDS-PAGE电泳，再转膜至PVDF膜，37 ℃条件下用5% BSA封闭1 h，分别加入兔抗人COX-2、p-NF-κB(p65)抗体，4 ℃摇床上孵育过夜；TBST洗膜，加入稀释比例为1 ∶1 000的辣根酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃条件下孵育2 h，TBST洗膜，暗室曝光、显影定影，分析结果。

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件分析数据，所有计量资料以均数±标准差表示，两样本间参数比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对LoVo细胞活力的影响

冬凌草甲素在15-240 μmol/L范围内均可抑制LoVo细胞的增殖(见图1)，抑制作用呈时间和浓度依赖性，药物浓度越高、作用时间越长，其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。

图1 冬凌草甲素对LoVo细胞增殖的影响Figure 1 The effect of oridonin on the cell proliferation of LoVo colorectal cancer cells

2.2 冬凌草甲素对LoVo细胞凋亡的影响

冬凌草甲素(浓度分别为0，30，60，120 μmol/L)处理LoVo细胞48 h后，细胞凋亡率分别为8.83%,15.5%,22.64%和25.86%(见图2)，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加。提示冬凌草甲素能诱导LoVo细胞凋亡。

2.3 冬凌草甲素对LoVo细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

0，30，60，120 μmol/L的冬凌草甲素处理LoVo细胞48 h后，Western blot结果显示随着药物浓度的升高，促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低(P<0.05,见图3)。

2.4 冬凌草甲素对LoVo细胞COX-2的影响

0，30，60，120 μmol/L浓度的冬凌草甲素处理LoVo细胞48 h后，COX-2表达逐渐降低(P<0.05,见图4)，表明冬凌草甲素可下调LoVo细胞COX-2表达。

图2 冬凌草甲素对LoVo细胞凋亡率的影响Figure 2 The effect of oridonin on the cell apoptosis of LoVo colorectal cancer cells

图3 冬凌草甲素对LoVo细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响Figure 3 The effect of oridonin on the expression of Bax and Bcl-2 in LoVo colorectal cancer cells

图4 冬凌草甲素对LoVo细胞COX-2蛋白表达的影响Figure 4 The effect of oridonin on the expression of COX-2 in LoVo colorectal cancer cells

2.5 冬凌草甲素对LoVo细胞PGE2产生的影响

PGE2作为COX-2的催化产物，与COX-2表达水平及活性密切相关。进一步探讨了30，60，120 μmol/L浓度的冬凌草甲素分别处理LoVo细胞48 h后对细胞上清液中PGE2浓度的影响，结果表明随着药物浓度的增加，细胞上清液中PGE2浓度明显降低(见图5)，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图5 冬凌草甲素对LoVo细胞PGE2合成的影响Figure 5 The effect of oridonin on the synthesis of PGE2 in LoVo colorectal cancer cells

2.6 冬凌草甲素对LoVo细胞NF-κB表达的影响

作为炎症反应的调控基因，NF-κB参与调控COX-2的表达，因此本实验进一步探讨冬凌草甲素对NF-κB/p65表达的作用，不同浓度的冬凌草甲素处理LoVo细胞48 h后，细胞核内p-NF-κB(p65)表达量减少，呈浓度依赖性(见图6)。

图6 冬凌草甲素对LoVo细胞核内p-NF-κB表达的影响Figure 6 The effect of oridonin on the expression of p-NF-κB within nucleus in LoVo colorectal cancer cells

3 讨论

本实验结果显示，冬凌草甲素可抑制LoVo细胞的增殖，且抑制作用呈时间和浓度依赖性，药物浓度越高、作用时间越长，其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。同时，本实验结果显示冬凌草甲素处理后可显著诱导细胞凋亡，呈浓度依赖性。这些结果表明，冬凌草甲素可能通过激活细胞凋亡通路抑制细胞增殖。

本实验检测了冬凌草甲素对凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达的影响。结果显示冬凌草甲素可下调LoVo细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达。抗凋亡蛋白Bcl-2主要存在于线粒体、内质网和核膜上，研究显示在多种肿瘤细胞中Bcl-2均成过表达状态，引起细胞持续增殖。Bcl-2可通过增强线粒体膜电位，保持线粒体内外膜的完整性，及抑制Ca2+释放，阻止核酸内切酶活化等多种机制抑制细胞凋亡，在肿瘤发生及发展中扮演着重要角色[8,9]；此外，Bcl-2还可通过与ERK等通路相互作用，调节细胞凋亡[10]。研究显示下调Bcl-2的表达可促进细胞凋亡，并可延长中路患者的生存期[11]；促凋亡蛋白Bax也属于Bcl-2家族，但其作用与Bcl-2相反，Bax即可与自身形成同源二聚体，又可与Bcl-2相互结合形成异源二聚体，Bcl-2表达上调时可促进自身与Bax结合形成异源二聚体，发挥抗凋亡作用，Bcl-2表达下调时，则出现相反的效应[12]。

包括结肠癌在内的多种肿瘤均高表达COX-2。作为PGE2合成过程的重要限速酶，过表达的COX-2又大量产生PGE2，二者共同参与肿瘤增殖、凋亡、侵袭及转移[13,14]。抑制COX-2及PGE2表达后可促进细胞凋亡、抑制血管新生、促进细胞免疫而发挥抗肿瘤作用。研究发现，COX-2抑制剂在一定程度上可预防胃肠道肿瘤及其他肿瘤[15,16]。由于COX-2在肿瘤发生发展过程中的重要作用，COX-2被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。本实验结果显示冬凌草甲素能显著降低LoVo细胞COX-2蛋白表达，并抑制PGE2的合成。

此外，NF-κB作为COX-2在炎症反应过程中的上游调控基因，本实验检测了冬凌草甲素对NF-κB/p65表达的影响。Western blot结果提示冬凌草甲素可降低细胞核内p-NF-κB(p65)表达，即冬凌草甲素可抑制LoVo细胞NF-κB的核内移位。

综上所述，冬凌草甲素可降低结肠癌LoVo细胞增殖，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制p-NF-κB(p65)转录，下调COX-2表达和PGE2合成。

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Oridonin inhibits proliferation of LoVo colorectal cancer cells through inhibiting the expression of NF-κB/COX-2

LIU Na,LI Wenqiang*,GAO Chengwei#

(DepartmentofEmergency,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;*Correspondingauthor,E-mail:wenqiang67@sohu.com；#Co-correspondingauthor,E-mail:gaochengweihubei@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of oridonin on the cell proliferation and apoptosis of LoVo colorectal cancer cells and its possible mechanisms.MethodsLoVo cells were culturedinvitroand treated with different concentrations(0-240 μmol/L) of oridonin for 24,48 and 72 h,respectively,and then the cell activity was determined by MTT assay. After treated with 0，30，60，120 μmol/L oridonin for 48 h, the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry, the expression of PGE2 in the culture medium was detected by ELISA, and Bcl-2,Bax,COX-2 and p-NF-κB(p65) protein expression was detected by Western blot.ResultsMTT result showed that the cell proliferation of LoVo cells was inhibited by oridonin in a dose-dependent and time-dependent manner(P<0.05). After treated with 0, 30，60，120 μmol/L oridonin, the cell apoptosis rate of LoVo cells was 8.83%,15.5%,22.64%,and 25.86%,respectively. ELISA result showed that the PGE2 synthesis was inhibited after treated with oridonin. The oridonin promoted the expression of pro-apoptotic factor Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2(P<0.05). Western blot showed that oridonin decreased the expression of COX-2 and p-NF-κB,and PEG2 synthesis(P<0.05).ConclusionOridonin could inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis in LoVo cells by inhibition of the expression of p-NF-κB for up-regulating Bax and down-regulating Bcl-2.

oridonin; LoVo cells; cell apoptosis; COX-2; PGE2

刘娜，女，1981-07生，本科，主治医师，E-mail：371264709@qq.com

2016-12-19

R735.35

A

1007-6611(2017)03-0251-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.011