川芎嗪对乳腺癌移植瘤小鼠的免疫学效应研究①

汪 悦，柳朝阳，荣光影，宋庆娇，张 涛

( 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

川芎嗪对乳腺癌移植瘤小鼠的免疫学效应研究①

汪 悦，柳朝阳，荣光影，宋庆娇，张 涛

( 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:研究川芎嗪对乳腺癌荷瘤裸鼠免疫功能的影响及其抑制肿瘤生长的作用。方法:将40只裸鼠进行分组，分为空白对照组(8只)和模型组(32只)，模型组给裸鼠皮下注射人乳腺癌MCF-7细胞，建立乳腺癌移植瘤模型，空白对照组不做任何处理。将模型组32只裸鼠随机分为荷瘤对照组和药物处理组(川芎嗪组、顺铂组、川芎嗪联合顺铂组)，每组8只，测定抑瘤率及脾脏指数；采用酶联免疫法检测川芎嗪对乳腺癌裸鼠免疫抑制因子血清白介素4(IL-4 )及肿瘤坏死因子(TNF-α)表达水平的影响；MTT法检测脾脏NK细胞杀伤活性。结果:川芎嗪促使裸鼠抑瘤率及脾脏指数升高，联用组抑瘤率明显高于川芎嗪单用组，差异有统计学意义；与空白组相比，荷瘤组血清IL-4 及TNF-α表达水平显著降低；与荷瘤组相比，川芎嗪组及顺铂组血清IL-4 及TNF-α表达水平升高，联合组血清IL-4 及TNF-α表达水平显著升高；与荷瘤对照组比较，川芎嗪组NK细胞活性升高，差异有显著性意义，且与顺铂联用时NK细胞活性显著提升。 结论:川芎嗪对小鼠乳腺实体瘤有一定抑制作用，而川芎嗪联合化疗药具有协同促进的治疗作用，其机制可能是通过提高小鼠免疫功能从而达到抑制肿瘤生长的效果。

川芎嗪；乳腺癌；脾脏指数；白介素4；肿瘤坏死因子α；NK细胞杀伤活性

乳腺癌是长期困扰女性健康的恶性肿瘤之一，呈现高复发率、高死亡率的特点，目前主要的治疗手段仍局限于手术、放化疗方案且无积极有效的预防措施，放化疗严重的毒副反应及对免疫系统的杀伤作用极大降低了患者的生存质量。因此，寻求高效低毒的中草药协同治疗成为抗乳腺癌的研究热点[1]。川芎嗪注射液是从中药单体川芎的生物碱中分离提取有效成分加工制成的灭菌水溶液[2]。前期研究证明川芎嗪对多种肿瘤宿主的免疫功能具有调节作用[3,4]，王[5]等研究发现川芎嗪对荷瘤裸鼠具有促进和恢复免疫功能的作用，同时拮抗荷瘤鼠NK活性降低，江[6]研究发现川芎嗪既能抑制血管内皮细胞的生长、分化，诱导肿瘤细胞凋亡，又能抑制肿瘤细胞VEGF的表达及VEGF诱导的血管内皮细胞增殖。川芎嗪注射液具有清除自由基、抑制某些实体瘤生长及转移、扩张血管等的药理学特性，其机制可能与提高机体免疫能力及自然杀伤细胞活性有关[7～11]，但目前川芎嗪对于MCF-7乳腺癌裸鼠免疫功能的影响尚未见报道。本研究旨在探讨川芎嗪对乳腺癌裸鼠免疫功能的影响及其抑制肿瘤生长的作用，为辅助临床治疗乳腺癌提供理论依据。

1 实验材料

1.1 材料

川芎嗪注射液40mg/2mL；(河南辅仁怀庆堂制药有限公司 批号H20003792)；IL-4、TNF-α检测试剂盒(华美生物工程公司)；MTT粉末(Sigma公司)；红细胞裂解液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；PBS粉末(碧云天生物技术有限公司)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2 实验动物

40只SPF级健康雌性4周龄BALB/c-nu裸鼠，20～22g/只，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号：scxle( 黑) 2014007。

2 实验方法

2.1 模型建立及动物分组

将对数生长期的MCF-7细胞调至密度为1×107/mL，于裸鼠左前肢腋下皮下注射0.2mL细胞悬液，接种人乳腺癌MCF-7细胞7d后，将接种肿瘤的裸鼠按随机数字表法分为4组：荷瘤模型组、川芎嗪组、顺铂组、川芎嗪联合顺铂组，每组8只。空白对照组及荷瘤模型组：每日腹腔注射0.9%生理盐水0.2mL；川芎嗪组：对小鼠进行腹腔注射，使用川芎嗪注射液100mL/kg，连续给药20d，每天注射一次；顺铂组：每隔一天给予顺铂注射液2.5mL/kg腹腔注射，总共注射10次；联合治疗组：川芎嗪注射液100mg/kg，腹腔注射，每天1次，连续20d，同时，给予顺铂注射液25mg/kg腹腔注射，每隔一天注射一次，连续10次。

2.2 抑瘤率测定

末次给药24h后处死实验小鼠，无菌取出瘤体并称量湿重，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。

2.3 脾脏指数测定

末次给药后24h称重，颈椎脱臼处死，无菌取脾，测量脾脏质量。脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)。

2.4 血清IL-4及TNF-α水平测定

末次给药24h后腹主动脉取血，待血液自然凝固，室温条件下，以2000r/min离心时间：20min，分离上清液分装于1.5mLEP管中，-20℃保存，按照ELISA试剂盒说明书操作进行检测。

2.5 脾脏NK细胞活性表达的测定

末次给药24h后，脱颈处死小鼠，无菌取脾置于平皿中加入PBS液，研碎，加入红细胞裂解液，离心去上清，吹打混匀加入RPMI-1640制备浓度为1×107/mL的脾细胞悬液，将K562作为靶细胞制成浓度为1×105/mL的细胞悬液，以1:1的比例混匀加入细胞培养板，MTT法测定NK细胞活性的吸光度(OD)值。NK细胞活性(%)=[OD靶细胞对照孔-(OD实验孔 -OD效应细胞对照孔)]/OD靶细胞对照孔×100%。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 瘤体质量及抑瘤率

与荷瘤对照组相比，川芎嗪治疗组瘤体质量降低(P<0.05)，顺铂组及川芎嗪联合顺铂组的肿瘤质量明显降低(P<0.01)，且联用组的肿瘤质量小于顺铂单用组；联用组的抑瘤率明显高于二者单用组(P<0.01)达到55.63%，提示川芎嗪能一定程度上抑制乳腺实体瘤的生长，且对于化疗药具有协同增效的作用。

表1 川芎嗪对瘤体质量及抑瘤率的影响±s,n=8)

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 对脾脏指数的影响

连续用药20d后，川芎嗪组较荷瘤对照组及顺铂组荷瘤鼠脾脏指数均有上升，差异具有统计学意义(P<0.05)，联合组脾脏指数较顺铂组高，但无统计学意义。提示川芎嗪可能通过增加机体免疫器官的质量，增强机体免疫应答的能力，提高机体的免疫功能。

表2 川芎嗪对小鼠免疫器官的影响±s,n=8)

与对照组比较，*P<0.05。

3.3 对血清IL-4及TNF-α的影响

与正常组血清IL-4水平相比，模型组血清IL-4含量明显下降(P<0.05)；与模型组相比，川芎嗪组及联用组血清IL-4含量明显升高(P<0.05)。比较血清TNF-α含量差异发现，与模型组相比，顺铂组血清TNF-α含量虽有所下降，但差异无显著性意义(P>0.05)，而川芎嗪组及联合组裸鼠血清中TNF-α含量显著上升(P<0.05)。由此说明，川芎嗪可能通过刺激机体分泌内源性免疫因子，抑制乳腺癌的生长、发展。

表3 川芎嗪对荷瘤小鼠血清IL-4及TNF-α的影响

与对照组比较，*P<0.05。

3.4 对NK细胞活性的影响

与荷瘤对照组比较，川芎嗪组NK细胞活性升高，差异有显著性意义(P<0.05)，且与顺铂联用时NK细胞活性显著提升(P<0.01)；提示川芎嗪对于小鼠免疫功能提升有促进作用，且能够拮抗化疗造成的免疫功能低下效应。

表4 川芎嗪对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响 ±s,n=8)

与对照组比较，*P<0.05。

4 讨论

脾脏是机体最大的免疫器官，是T、B淋巴细胞分化成熟的场所，脾脏系数升高表明T、B淋巴细胞及抗体分泌量的增加，充分发挥机体细胞免疫与体液免疫的作用，有助于免疫功能的增强[12]。与模型对照组相比，川芎嗪联合化疗药组裸鼠脾脏系数较单用化疗组与川芎嗪组明显升高，且差异具有统计学意义，说明川芎嗪可能通过增强宿主免疫功 能抑制肿瘤细胞的生长。

IL-4由Th2型细胞所分泌，主要介导体液免疫，能够调节淋巴细胞的分泌和宿主免疫功能。川芎嗪联合化疗药组及川芎嗪组IL-4含量较模型组显著升高，据此推断，川芎嗪可能通过刺激IL-4分泌实现抑制肿瘤生长的效果。川芎嗪联合化疗药组的IL-4含量明显高于川芎嗪组，提示川芎嗪具有一定增强化疗效果的作用。TNF-α可诱导细胞凋亡、坏死、血管生成、免疫细胞活化等多种反应，已有研究证实，TNF-α通过间接升高肿瘤相关血管内皮细胞渗透能力，选择性破坏肿瘤脉管系统，进而导致肿瘤出血性坏死[13]。相较于模型组，川芎嗪联合化疗药组及川芎嗪组血清TNF-α含量显著上升，与文献报道一致。

NK细胞具有无需抗原预先致敏、无需抗体或补体、无MHC限制性、通过血液循环可直接杀伤某些特定肿瘤细胞的特性，构成人体抵御肿瘤侵袭的第一道防线，NK细胞杀伤活性的高低是衡量机体免疫功能强弱的关键因素[14]。川芎嗪联合化疗药组的NK细胞杀伤活性明显高于单用组，说明川芎嗪可能通过提高NK细胞杀伤活性促进免疫功能的恢复发挥抗肿瘤的作用。

由此可见，川芎嗪可有效增强乳腺癌荷瘤裸鼠的免疫功能，对化疗起到协同增效的作用，达到抑制肿瘤生长的目的。具体作用机制仍有待深入研究。

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1.黑龙江省自然科学基金资助项目，编号：H2015074；2.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目，编号：1252G059；3.黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201510222026。

汪悦(1990～)女，湖北黄石人，在读硕士研究生。

张涛(1971～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail：961836085@qq.com。

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1008-0104(2017)01-0031-03

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