TLR4在原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中的表达①

孙佳斌，李晓光，逄德志，张金波，谢伟裕，郑佳音，王茉琳

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

TLR4在原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中的表达①

孙佳斌，李晓光，逄德志，张金波，谢伟裕，郑佳音，王茉琳

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨TLR4信号通路在原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中的表达情况。方法：利用Western-blot检测实验组与对照组患者外周血单个核细胞中TLR4、NF-κB的蛋白表达情况，应用ELISA法检测各组受试对象血浆IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表达情况。结果：实验组TLR4、NF-κB的蛋白表达水平，血浆IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论：原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中TLR4信号及相关致炎和抗炎因子表达异常，TLR4可能通过调节免疫反应参与原发性高尿酸血症患者病程的发生与发展。

TLR4；高尿酸血症；炎症

高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症[1]。研究表明HUA与心脑血管系统疾病、内分泌疾病和慢性肾脏疾病等密切相关，是这些疾病发生和发展的独立危险因素[2]。有报道显示在无症状高尿酸血症患者中存在微炎症状态[3]，Toll受体活化后会募集MyD88 (myeloiddifferentiationfactor-88)，进而激活核转录因子-KB(Nuclearfactor-kappaB,NF-kB)，活化的NF-KB启动促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子等相关靶基因的转录，这些细胞因子在炎症反应中发挥着关键作用，经过一系列复杂的生化反应产生级联放大效应[4]。本研究通过检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)Toll样受体的表达水平，核蛋白NF-κBp65、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量，血浆尿酸浓度，分析Toll样受体与痛风炎症反应之间的联系及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2015-06～2016-05在佳木斯大学附属第一医院就诊及体检人群50例，其中健康对照(HC)20例，男18例，女2例，年龄(45.25±5.37)岁，原发性高尿酸血症(HUA)30例，男27例，女3例，年龄(47.58±5.82)岁，入选者需符合原发性高尿酸血症诊断标准，并排除心血管系统疾病、糖尿病、痛风、肿瘤、急性感染性疾病及自身免疫病。各组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂与仪器

TLR4、NF-κB抗体购自美国Santacruze公司，人IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10酶联免疫吸附试剂盒购自博士德生物工程有限公司，淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；电泳仪(天能公司)，酶标仪(Gene公司)，低温高速离心机(Beckman公司)。

1.3 样本采集

抽取实验组与对照组受试者静脉血5mL，2000r/min离心10min取血浆，剩余的血细胞用PBS稀释后加入淋巴细胞分离液上层，2000r/min离心10min，吸取悬浮在中层的单个核细胞，PBS洗3次，-80℃保存备用。

1.4 蛋白提取及Western-blotting检测

常规方法提取脑组织蛋白，BCA法蛋白质浓度测定。上样，浓缩胶80V，分离胶120V恒压电泳，恒流200mA电流，转膜1h。牛奶封闭1h，一抗4℃过夜，二抗孵育，ECL显影。

1.5 酶联免疫吸附实验测定血浆细胞因子

按说明书操作，配制标准品，稀释血清样本，上样、孵育、洗板等，读取吸光值，绘制蛋白标准曲线，计算血清样本浓度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组受试者血尿酸水平的比较

HC组受试者尿酸值为312.28±81.35，HUA组受试者尿酸值为533.11±72.91，HUA组血尿酸水平显著高于HC组(P<0.05)。

2.2NLRP3炎性体蛋白表达情况

随着尿酸水平的升高，实验组TLR4、NF-κB的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见图1、表1。

2.3 血浆IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表达

实验组IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表2。

图1 Western检测各组TLR4、NF-κB蛋白表达情况

表1 各组TLR4、NF-κB蛋白的表达情况

表2 血浆IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表达

3 讨论

TLR4做为固有免疫的模式识别受体，能够识别多种微生物及代谢物的激活信号如胰岛淀粉样多肽、胆固醇晶体、尿酸盐晶体等[5]，有报道显示可溶性尿酸盐较MUS更易刺激TLR4和IL-1β的表达。因此我们假设TLR4作为炎症反应的始动器，可能参与高尿酸血症患者体内炎症反应的发生、发展。本研究显示原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中TLR4、NF-κB的表达水平高于对照组，表明TLR4介导的炎症反启动了高尿酸血症患体内的炎症状态，同时参与了病程的进展。TLR4被激活后可以进一步激活炎症反应的诱发因子IL-1β和IL-8，进一步放大机体的炎症反应，IL-1β是促进多种代谢性疾病发生、发展的重要炎症因子,IL-8作为一种趋化因子，能激活中性粒细胞、嗜碱性粒细胞，使大量中性粒细胞向炎症部位聚集，因此，IL-8既是免疫反应的启动因子，又是持续炎症反应的诱发因子。本研究显示原发性高尿酸血症患者血浆中IL-1β和IL-8表达水平显著高于对照组，证实IL-1β和IL-8被TLR4激活后能进一步扩大炎症反应，参与病程进展。此外，本研究发现HUA组血浆IL-4、IL-10等抗炎性因子均显著升高，提示机体通过免疫调节释放抗炎性细胞因子，以便抑制和减轻由炎性细胞因子导致的炎症状态。总之，探讨原发性高血尿症患者TLR4信号及其相关的细胞因子表达变化，对于高尿酸血症病程的进展，炎症反应之中的作用，预防合并症的发生、发展有着重要的临床意义。

[1]李复兴. 饮水与高尿酸血症[J].中国食品,2016，(3):36

[2]邹大进.无症状高尿酸血症治疗的必要性[J].中华医学会第十三次全国内分泌学学术会议会议指南，2014,(8):136-138

[3]赵劲涛，黄胜华，连希艳，等. 无症状高尿酸血症对微炎症状态的影响[J].临床内科杂志, 2012, 29(7):460-462

[4]PaulPT,GarySF.NF-κB:akeyroleininflammatorydiseases[J].JClinInvest,2001，107(1):7-11

[5]ShawPJ,McDermottMF,KanneganitiTD.Inflammasomesandautoimmunity[J].TrendsinMolecularMedicine,2011,17(2):57-64

The study on the expression of TLR4 in patients with primary hyperuricemia

SUNJia-bin,LIXiao-guang,PANGDe-zhi,

ZHANGJin-bo,XIEWei-yu,ZHENGJia-yin,WANGMo-lin

(Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the expression of TLR4 signal pathway in patients with primary hyperuricemia. Methods: TLR4, NF-κB were measured by using Western-blot between experimental group and control group. The expressions of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 were measured by using ELISA in plasma with all groups. Results: The expression of TLR4、NF-κB gene protein increased significantly, and the expression of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 increased significantly in patients with experimental groups compared with control group. Conclusion: Dysregulated expression of TLR4, associated inflammatory and anti inflammatory cytokinesis with it may be involved in the development of disease by regulating inflammotatory response; and play a key role in the primary hyperuricemia.

TLR4;primary hyperuricemia;inflammation

1. 黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201610222051；2.黑龙江省卫生计生委科研课题，编号：2014-264；3.佳木斯大学青年项目，编号：Sq2013-019；4.佳木斯大学面上项目，编号：JMSUJCM2016-043。

孙佳斌(1994～)男，黑龙江佳木斯人，在读本科学生。

王茉琳(1981～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。E-mail:81molin@163.com。

R

A

1008-0104(2017)01-0015-02

2016-10-20)