骨髓细胞瘤禽白血病的实验室诊断

杨 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陈 红 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(贵阳市动物疫病预防控制中心， 贵州贵阳550081)

骨髓细胞瘤禽白血病的实验室诊断

杨 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陈 红 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(贵阳市动物疫病预防控制中心， 贵州贵阳550081)

禽白血病是由禽白血病病毒(avianleucosisvirus，ALV)引起的多种肿瘤性疾病的总称，主要以造血细胞恶性增生为特征，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、血管瘤病、骨髓细胞瘤病、骨化石病等。由鸡分离的ALV 分为A、B、C、D、E、J 6个亚群，在自然条件下，由ALV导致的肿瘤病例主要是A、B亚群引起的，J亚群则主要引起肉用型鸡髓样细胞性肿瘤。自Payne等[1]首次从肉用型鸡群中分离并鉴定出ALV J亚群后，该病原已在世界范围内传播流行，我国于1999年首次报道了商品肉鸡感染ALV J[2]亚群，并陆续在江苏、内蒙古、宁夏、山东和广东等地中分离鉴定到该病原[3]。

近期，贵州省某铁脚麻肉鸡规模场所饲53日龄鸡出现消瘦，精神委靡，食欲减退，体重下降，鸡冠萎缩苍白，羽毛异常，腹部膨大等疑似J亚群禽白血病症状，发病率达12%，死亡率达5.3%。本试验通过血清学检测、病理组织学观察及分子生物学检测等方法对该场患病鸡进行了确定性诊断。现将诊断结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样品 120份不同日龄鸡血清样本，6只病死鸡肝脏、肾脏、脾脏组织，均采自贵州省某铁脚麻肉鸡规模场。

1.2 材料 禽白血病J亚群抗体检测试剂盒，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；甲醛、H.E.染料等病理试剂，本实验室配制保存；参照文献[4]，在pol基因的3′端和gp85编码基因的内部设计了1对引物H5/H7(引物序列见表1)，引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成；PCR扩增试剂，购自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 引物序列

1.3 禽白血病J亚群抗体检测 将待检样品以样品稀释液进行500倍稀释，设阴、阳性对照各2孔，每孔加100 μL待检样品，封口膜封板后室温孵育30 min。以350 μL洗涤液洗板5次，每孔加酶标抗体100 μL，室温孵育30 min后洗涤5次。每孔加入100 μL TMB底物液，室温下作用15 min终止液终止反应，测定各孔OD650 nm值。待检样品S/P比值(S/P=样品平均值-阴性对照平均值/阳性对照平均值-阴性对照平均值)小于或等于0.6时，待检样品判为阳性。

1.4 组织病理学观察 对出现肿瘤病变或疑似肿瘤的病死鸡进行病体剖检，观察大体病变并记录。同时，取肝、肾、脾，以10%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋切片，H.E.染色后镜检，观察组织病理变化。

1.5 分子生物学诊断 按SDS-Proteinase K法提取病死鸡肝脏样本总DNA。建立PCR反应体系50 μL，依次加入10×PCR Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、Taq酶(2.5 U)1 μL、上下游引物(20 mmol/L)各1 μL、DNA模板2 μL，灭菌ddH2O 补足。PCR反应按下列条件进行：95 ℃预变性5 min，然后进入35个循环，94 ℃变性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸10 min。PCR扩增完成以后，取5 μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 禽白血病J亚群抗体检测结果 以禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对不同日龄铁脚麻肉鸡血清样板进行抗体检测，结果见表2。

由表2可知，该场所饲不同日龄铁脚麻肉鸡均检测到J亚群禽白血病抗体阳性，其中150日龄为33.3%，220日龄为23.3%，270日龄为13.3%，450日龄为30.0%。初步判定，该场鸡群存在ALV J亚群感染情况。

表2 鸡群禽白血病J亚群抗体检测结果

2.2 病死鸡剖检观察结果 对6只病死鸡进行病体剖检，观察到：肝脏明显肿大，几乎占据整个腹腔、色变淡，有大小不等的灰白色肿瘤结节(见中插彩版图1)；脾显著肿大，有白色肿瘤病灶，包膜紧张，切面外翻(见中插彩版图2)；腔上囊萎缩或消失；肠管浆膜而及胰腺表面有灰白色结节；盲肠扁桃体出血。

2.3 组织病理学诊断结果 采用H.E.染色法，制备肝、肾、脾组织切片，于显微镜下进行组织病理学观察，结果(见中插彩版图3、4)。

由图可知，在肝脏切片中可见大量增生的髓细胞样瘤细胞，在中央静脉周围和肝细胞索之间，瘤细胞成簇分布或分散存在，正常的肝细胞索结构被破坏、萎缩或消失，受挤压的肝细胞发生空泡变性，胞核模糊淡染，或仅残留核影，出现典型的核溶解现象。髓细胞样瘤细胞体积较大，呈圆形或椭圆形，胞核常偏于一侧，染色质较疏松，胞浆丰富，含有大量嗜酸性颗粒。在肝窦状隙中，除观察到瘤细胞浸润以外，尚发现数量不等的淋巴细胞和红细胞。在肾脏切片中髓细胞样瘤细胞在血管附近灶状集聚，或分散存在于肾间质中，肾小管上皮细胞呈现肿胀-变性-坏死的不同阶段，甚至脱落而成为空泡样结构。在脾脏切片中鞘动脉周围也可见少量髓细胞样瘤细胞浸润，白髓体积缩小，淋巴细胞稀疏。组织学诊断结果判定为由ALV J亚群所致骨髓细胞瘤禽白血病。

2.4 J亚群禽白血病病毒核酸检测 以J亚群禽白血病病毒特异性引物H5/H7对6只肿瘤病死鸡肝脏所提DNA进行PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。

由图5可知，6只病死鸡肝脏所提DNA经J亚群禽白血病病毒特异性引物H5/H7检测，均扩增到545 bp目的条带，与预计扩增大小相符。进一步表明，该场鸡群发生骨髓细胞瘤禽白血病的病原为ALV J亚群。

图5 J亚群禽白血病病毒核酸检测结果

M：200 bp DNA Marker；1:阴性对照； 2：阳性对照； 3-8：病死鸡肝脏

3 讨论

目前，J亚群禽白血病已呈全球性流行，因该病所致肿瘤和生产性能下降，给养禽业造成了严重的经济损失[6]。近年来，由ALV J亚群感染所引起骨髓细胞瘤型禽白血病也陆续在国内各地报道[5]。本试验对贵州省某铁脚麻肉鸡规模场疑似患病鸡群进行了血清抗体检测，结果显示，不同日龄鸡群中存在ALV J亚群感染情况，J亚群禽白血病抗体阳性率在13.3%～33.3%之间。通过组织病理学诊断，发现病死鸡肝脏切片中有大量增生的髓细胞样瘤细胞，这与文献报道一致[6]。并根据对病死鸡肝脏、脾脏与肾脏的分子生物学检测结果，表明引起该场肉鸡疫病的是由ALV J亚群所致骨髓细胞瘤禽白血病。

资料显示[7]，ALV J亚群感染鸡后，除致鸡发生肿瘤疫病外，还能导致鸡群发生严重的免疫抑制，使混合感染几率增大，常见如鸡马立克病病毒、鸡传染性贫血病毒、沙门菌等病原易与ALV J亚群混合感染鸡发病[10]，因此，病鸡临床表现复杂，发病率和死亡率上升。另外，ALV J亚群易感鸡群日龄不断提前，在肉鸡中从最早27日龄发病已提前到现在的24日龄。因此，在目前临床上暂无该病有效疫苗的情况下，养禽场应着重从疫病净化的角度做好防控工作。

[1] Payne L N,Brown S R,Burumstead N,etal．A novel subgroup of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Gen Virol,1991,72:801-807.

[2] 杜岩,崔治中,秦爱建.从市场商品肉鸡中检出J亚群白血病病毒[J].中国家禽学报,1999,1:1-4.

[3] 高玉龙,邵华斌,罗青平,等.2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2010,32(1):32-35.

[4] 徐镔蕊,董卫星,余春明.蛋鸡J亚群禽白血病的分子生物学诊断[J].病毒学报,2005,21(4):289-292.

[5] 张康,龚振华,刘坤,等.华东北部地区禽肿瘤性传染病流行病学调查[J].中国动物检疫,2013,30(8):55-57.

[6] 王金玲,丁玉林,赵振华,等.J亚群禽白血病病毒人工感染肉鸡病理学及组织嗜性研究[J].中国家禽,2011,33(8):50-52.

[7] 张立军.J亚群禽白血病及致病机理[J].山东畜牧兽医,2013,34(10):62-63.

2015-11-16

杨峰(1980-),男,高级兽医师,硕士,从事动物防疫工作,E-mail：506031129@qq.com

方英，E-mail:fy6565@126.com

S855.3

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0529-6005(2017)02-0047-02