耳念珠菌研究进展

杨燕，孙倩，孙长贵

(中国人民解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

耳念珠菌研究进展

杨燕，孙倩，孙长贵

(中国人民解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

耳念珠菌是一种近年来出现的酵母，可引起侵袭性感染，对氟康唑等抗真菌药物呈现多重耐药性，感染患者具有较高的死亡率。传统的实验室表型鉴定方法可能会导致错误鉴定结果，需要采用分子生物学方法或质谱技术区别耳念珠菌与其他念珠菌。因此，应引起临床和实验室人员的关注，注意感染防控。

耳念珠菌；耐药性；感染

近30多年来，真菌感染在医院感染中越来越常见，感染发生率也在上升。耳念珠菌(Candidaauris)是一种近年来出现的酵母，2009年由日本学者首先报道[1]。此后，在世界各地陆续出现其引起感染的报道[2-6]。该菌株可引起侵袭性感染，对氟康唑等抗真菌药物呈现多重耐药性，感染患者具有较高的死亡率，已引起国外学者的关注。本文简要综述耳念珠菌的研究进展。

1 流行病学

耳念珠菌于2009年首先由日本学者报道，分离于一住院老年女性患者外耳道[1]。此后，韩国[2-3]、印度[4]、南非[5]和科威特[6]等国家学者陆续报道耳念珠菌引起临床感染病例，尤其是真菌血症。耳念珠菌除可引起血流感染、伤口感染和耳炎，也可分离自呼吸道和尿液标本，但从这些部位分离出菌株是否表示感染或定植还不清楚。在巴西、哥伦比亚、委内瑞拉、美国、英国和巴基斯坦也有该菌株被检出[7-10]。

耳念珠菌感染可引起医院内暴发流行，涉及不同年龄段患者，感染途径与其他病原性念珠菌感染类似。感染的危险因素通常也与其他念珠菌相似，包括糖尿病、手术、使用抗生素或抗真菌药物、接受化疗、慢性肾病透析、HIV感染、机械通气、导尿管和中心静脉导管的使用等[4,8,11]。

扩增片段长度多态性和多位点序列分型结果表明，尽管在同一国家或地区内引起感染的菌株有关联，但不同国家之间感染菌株的基因型可有所区别[4,7-8,12-13]。这种差异的原因以及传播机制尚不可知。

鉴于耳念珠菌的感染和流行，美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)和英国公共卫生部(Public Health England，PHE)分别发布了有关耳念珠菌感染的医疗机构临床警示和实验室研究、管理和感染预防控制指南[9-10]。提醒医疗机构人员应重视和认真对待耳念珠菌引起的感染。

2 生物学特性与鉴定

2.1 生物学特性 文献[1]描述：在含葡萄糖、酵母浸膏和蛋白胨肉汤培养基中25 ℃培养3 d，可形成沉淀物，菌细胞呈卵圆形、椭圆形或拉长，大小(2.0～3.0) μm ×(2.5～5.0) μm，成单、双或成群排列。在麦芽汁琼脂培养基上25 ℃培养1个月后，划线培养物呈黏性奶油状，灰白色，边缘光滑和反光。在玻片玉米粉琼脂培养基上，25 ℃培养59 d不产生假菌丝。最适生长温度为37～40 ℃；在42 ℃缓慢和弱生长，而45 ℃则不生长。可在无维生素培养基生长，在50%葡萄糖和10%氯化钠/5%葡萄糖培养基中生长良好。在含0.1%和0.01%的放线菌酮中不生长。发酵葡萄糖，弱发酵蔗糖和海藻糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖或棉子糖。同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-海藻糖、D-棉子糖、D-松三糖、可溶性淀粉、半乳糖醇、D-甘露醇、山梨醇和柠檬酸盐，弱同化菊糖、核糖醇，不同化D-半乳糖、L-山梨糖、D-纤维二糖、乳糖、蜜二糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、核糖、L-鼠李糖、D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、甲醇、乙醇、甘油、赤藓糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、水杨苷、D-葡萄糖酸盐，DL-乳酸盐、琥珀酸盐、肌醇、十六烷、2-酮基-D-葡萄糖酸盐和木糖醇。可利用硫酸铵、尸胺和L-赖氨酸作为唯一氮源；不利用亚硝酸钠、硝酸钾和乙胺。尿素酶活性和重氮蓝B反应为阴性。来源于印度、南非和科维特的分离株可同化NAG[4-6]。菌株DNA G + C含量为45.3 mol%。

2.2 鉴定与鉴别 在种系发生上，耳念珠菌与希木龙念珠菌(Candidahaemulonii)相关，其生化特性与希木龙念珠菌、Candidaduobushaemulonii和无名念珠菌等菌株相似，常规表型鉴定易被一些商品化鉴定系统(如Vitek 2和API 20C-AUX)错误鉴定为希木龙念珠菌、Candidaduobushaemulonii、无名念珠菌、清酒念珠菌(Candidasake)、酿酒酵母或黏红酵母[4,8,14]。耳念珠菌无假菌丝和芽管形成，在科玛嘉念珠菌培养基上呈粉色，能在40 ℃生长，而希木龙念珠菌和Candidaduobushaemulonii可形成假菌丝和芽生孢子，但不能在40 ℃生长[4,14]。黏红酵母在沙氏培养基上呈粉色，易于鉴别。耳念珠菌虽然在科玛嘉培养基上呈粉色，但其他几种念珠菌亦呈粉色，因此显色培养基不是鉴定耳念珠菌的首选。

目前通过分子生物学方法如内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)和D1/D2区域基因测序是鉴定耳念珠菌的金标准[8-10,12,14]。扩增核糖体亚单位ITS区域使用的引物为ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTTGCGG-3′)和 ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；大核糖体亚单位D1/D2区域扩增使用的引物为NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAG

GAAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)，扩增产物测序后在GenBank上进行碱基局部对准检索工具(basic local alignment search tool，BLAST)比对以鉴定到种[12,14]。可用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)获得该菌的蛋白质图谱，对其进行鉴定[7,12-14]，前提是数据库中有该菌株的数据。采用MALDI-TOF MS对耳念珠菌进行鉴定时，根据厂商对酵母菌鉴定的要求进行操作，均能获得较高的鉴定分值(分值≥2)[14]。如果常规表型方法鉴定到希木龙念珠菌、无名念珠菌、清酒念珠菌或酿酒酵母时，应进一步做ITS和D1/D2基因测序或MALDI-TOF MS检测，以排除耳念珠菌的可能。

3 体外药敏及耐药

耳念珠菌由于其多重耐药性，受到国外学者和权威机构高度关注[8-10,15-16]。虽然当前尚未建立耳念珠菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)解释标准，但参考其他念珠菌的解释标准，结果发现几乎所有菌株对氟康唑高度耐药，半数以上对伏立康唑耐药，1/3菌株对两性霉素B耐药(MIC≥2 μg/mL)，少数菌株对棘白菌素也耐药[9-10]。Kathuria等[14]用美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定90株耳念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性，结果显示对氟康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶和卡泊芬净存在较高的MIC90值，分别为64、4、8和1 μg/mL，对其他抗真菌药物的MIC范围、MIC90和MIC50测定结果见表1。这些对唑类、多烯类和棘白菌素类等主要抗真菌药物耐药株的流行，限制了临床对治疗药物的选择，给治疗该菌株引起的感染带来很大的困难，应引起临床医生的关注。常规工作中鉴定到该菌株时，应及时进行抗真菌药物敏感性试验，以尽早给临床提供实验结果，便于临床正确选择药物。

表1 90株耳念珠菌对常用抗真菌药物的体外敏感性[14]

注：AMB，两性霉素B；ITC，伊曲康唑；VRC，伏立康唑；ISA,艾沙康唑；POS，泊沙康唑；FLU，氟康唑；5-FC，5-氟胞嘧啶；CAS，卡泊芬净；MFG，米卡芬净；AFG，阿尼芬净。

目前，耳念珠菌对抗真菌药物耐药机制还不是很清楚，其耐药性可能是在抗真菌药物选择压力下诱导快速突变而导致。最近发现，耳念珠菌基因组中存在单一拷贝的ERG3、ERG11、FKS1、FKS2和FKS3基因，其基因组的一个重要部分编码ABC和MFS转运蛋白家族以及药物转运蛋白，可能是耳念珠菌产生特殊的多重耐药性的原因[8,17]。

4 感染预防与控制

最近PHE发布的指南指出，耳念珠菌定植很难根除且趋于持续存留。医务人员的工作团队中必须包括微生物学专家，其工作必须在专业的感染控制专家指导下进行[10]。

耳念珠菌感染控制措施包括以下几点[8,10]。(1)隔离感染或定植患者。(2)医务人员应严格执行标准化的接触预防措施，包括手卫生(如使用肥皂和水洗手后再乙醇搓手)，穿工作服和戴手套。(3)对环境和污染物采取常规的感染预防和控制措施，包括普通清洁推荐使用含氯消毒剂，终末去污染考虑采用过氧化氢蒸气法或紫外线设备等。但这些对普通真菌有效的清洁和去污染的方法，对耳念珠菌都未被证实有效；应开展体外实验来研究其效果。耳念珠菌感染或定植患者床旁重复使用的设备应加强管理和清洁，包括血压计袖带和听诊器等每天使用的小设备以及监护设备和X光机等大设备。(4)必须与处置其他医疗相关多重耐药微生物一样，严格处理相关医疗废弃物。

5 结语

耳念珠菌是一种能引起侵袭性感染并危及生命的多重耐药菌株，感染多见于念珠菌血症。由于常见的表型鉴定及微生物鉴定系统均无法准确鉴定耳念珠菌，因此，常导致临床微生物学实验室对该菌株的鉴定错误。正确鉴定该菌株需使用分子生物学手段如ITS和D1/D2区域基因测序以及MALDI-TOF MS方法。耳念珠菌对唑类药物高度耐药，对其他抗真菌药物的MIC值也有所提高，其定植亦很难根除且趋于持续留存。多重耐药耳念珠菌的感染和流行，给临床抗感染治疗带来挑战，应引起国内临床医生和微生物学检验人员的关注。

[1]Satoh K, Makimura K, Hasumi Y,etal.Candidaaurissp. nov., a novel ascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital[J]. Microbiol Immunol, 2009,53(1):41-44.

[2]Kim MN, Shin JH, Sung H,etal.Candidahaemuloniiand closely related species at 5 university hospitals in Korea: identification, antifungal susceptibility, and clinical features[J]. Clin Infect Dis，2009;48(6):e57-61.

[3]Lee WG, Kang MG, Park KH. First three reported cases of nosocomial fungemia caused byCandidaauris[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(9):3139-3142.

[4]Chowdhary A, Sharma C, Duggal S,etal. New clonal strain ofCandidaauris, Delhi, India[J]. Emerg Infect Dis, 2013,19(10):1670-1673.

[5]Magobo RE, Corcoran C, Seetharam S,etal.Candidaauris-associated candidemia, South Africa[J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20(7):1250-1251.

[6]Emara M, Ahmad S, Khan Z,etal.Candidaauriscandidemia in Kuwait, 2014[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(6): 1091-1092.

[7]Calvo B, Melo AS, Perozo-Mena A,etal. First report ofCandidaaurisin America: clinical and microbiological aspects of 18 episodes of candidemia[J]. J Infect, 2016,73(4):369-374.

[8]Chowdhary A, Voss A , Meis JF. Multidrug-resistantCandidaauris: ′new kid on the block′ in hospital associated infections?[J]. J Hosp Infect, 2016, 94(3): 209-212.

[9]US Centers for Disease Control and Prevention. Global emergence of invasive infections caused by the multidrug-resistant yeastCandidaauris[R/OL]. (2016-07). http://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/candida-auris-alert.html.

[10]Public Health England. Guidance for the laboratory investigation, management and infection prevention and control for cases ofCandidaauris[S/OL]. (2016-07). https://www.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/534174/Guidance_Candida_auris.pdf.

[11]Ben-Ami R, Olshtain-Pops K, Krieger M,etal. Antibiotic exposure as a risk factor for fluconazole-resistantCandidabloodstream infection[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(5): 2518-2523.

[12]Prakash A, Sharma C, Singh A.etal. Evidence of genotypic diversity amongCandidaaurisisolates by multilocus sequence typing, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and amplified fragment length polymorphism[J]. Clin Microbiol Infect, 2016, 22(3):277.e1-277.e9.

[13]Girard V, Mailler S, Chetry M,etal. Identification and typing of the emerging pathogenCandidaaurisby matrix-assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry[J]. Mycoses, 2016, 59(8):535-538.

[14]Kathuria S, Singh PK, Sharma C,etal. Multidrug-resistantCandidaaurismisidentified asCandidahaemulonii: characterization by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and DNA sequencing and its antifungal susceptibility profile variability by Vitek 2, CLSI broth microdilution, and Etest method[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53 (6):1823-1830.

[15]Britz E, Govender NP. Global emergence of a multi-drug resistant fungal pathogen,Candidaauris[J]. South Afr J Infect Dis, 2016,31(3):69-70.

[16]Chowdhary A, Kumar VA, Sharma C,etal. Multidrug-resistant endemic clonal strain ofCandidaaurisin India[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(6):919-926.

[17]Sharma C, Kumar N, Pandey R,etal. Whole genome sequencing of emerging multidrug resistantCandidaaurisisolates in India demonstrates low genetic variation[J]. New Microbes New Infect, 2016, 13: 77-82.

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.17

杨燕，1980年生，女，硕士，从事临床微生物学检验研究。

孙长贵，主任技师，教授，硕士研究生导师，E-mail:suncgui@163.com。

R446.5

A

2016-11-13)