FK506结合蛋白5在肝细胞癌中的表达及其临床意义

闫亭亭，龙晨，蔡文武，王继龙

（1． 中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410008；2． 中南大学湘雅二医院 普通外科，湖南 长沙410011）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型[1]，其发病率和病死率分别位居全球恶性肿瘤的第5位和第2位[2-3]。手术切除和肝移植是早期肝癌目前最常见的根治手段[4-5]。但由于术后较高的复发率和转移率，HCC患者预后依然较差[6]，术后5年生存率只有24%～50%，甚至更低[7-9]。因此，寻找能够用于预后预测和治疗的分子标志物依然是当前HCC研究的热点和难点。

FK506结合蛋白5（FK506 binding protein 5，FKBP5），又称FKBP51（FK506 binding protein 51），是亲免素蛋白家族成员之一[10]，具有调节多种生物学过程的作用，如免疫调节、类固醇激素受体活化、细胞生存、蛋白质合成、折叠和运输等[11]。近年来研究发现，FKBP5在肿瘤发生发展过程中也起着重要作用[12]。FKBP5在黑色素细胞瘤[13]、前列腺癌[14-15]、食管腺癌[16]、神经胶质瘤[17]等肿瘤组织中呈高表达，且与细胞侵袭、转移及肿瘤耐药等密切相关。但也有文献[18]显示FKBP5在胰腺癌组织中呈低表达。这提示FKBP5在不同肿瘤中的表达具有组织特异性。目前，尚无文献报道FKBP5在HCC组织中的表达情况。本研究拟采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法，检测FKBP5在HCC组织中的表达情况，并分析其与HCC患者临床病理特征及预后的关系，为正确评估HCC生物学行为和预后提供有用指标。

1　材料与方法

1.1　临床标本

随机选取中南大学湘雅二医院2009年5月—2011年1月期间接受手术切除的HCC患者的石蜡标本107例，包括HCC组织及相应癌旁组织，且经病理学检查确诊。所有患者均具有完整的临床病理资料（表1），术前未进行放、化疗等辅助治疗。随访的方式主要采取定期复查及电话随访，随访截止于2015年10月，中位随访时间为35（2.0～75.0）个月。另收集30对HCC及相应的癌旁非肿瘤肝组织（距肿瘤＞2cm）新鲜标本，在手术切除后立即取样，分别装入冻存管中，迅速冷冻于液氮并于-80℃冰箱中保存。本研究由中南大学湘雅二医院伦理委员会审核批准，并经过研究对象或其家属知情同意。

1.2　试剂

RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司，qRT-PCR反应试剂盒购自TaKaRa生物技术公司，引物合成由上海生工生物公司完成，FKBP5引物序列上游：TTT GAC TGC AGA GAT GTG GC，下游：CCT GCC TCT CCA AAA CCA TA；内参GAPDH引物序列上游：GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G，下游：ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A。RIPA裂解液购自北京康为世纪生物公司，BCA蛋白定量分析试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，PVDF膜购自美国Milipore公司，ECL试剂盒购自江苏碧云天公司。FKBP5一抗为兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz），WB工作液浓度1:100，IHC工作液浓度1:50。β-actin一抗为鼠抗人单克隆抗体（Sigma），WB工作液浓度1:1 000。免疫组织化学二步法检测试剂盒（PV-9000）、进口山羊血清工作液和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3　方法

1.3.1qRT-PCR 取新鲜组织50 mg，采用TRIzol法抽提总RNA，按照Takara试剂盒逆转录成cDNA。在7300 Real Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）上进行荧光实时定量PCR，设置好反应条件后启动PCR反应，具体条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃延伸60 s，共40个循环。每个样本设3个复孔，分别记录FKBP5和GAPDH的Ct（Cycle threshold）值，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算FKBP5在HCC组织中的相对表达水平。

1.3.2蛋白质提取和Western blot检测 研磨好的新鲜HCC及癌旁组织用RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白样品混合上样缓冲液后100 ℃变性10 min，取50 μg总蛋白上样，以10%SDS-PAGE胶电泳分离后经电转移槽湿转法转到PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭30 min；PBST漂洗3次后将PVDF膜置入FKBP5或β-actin一抗，4 ℃过夜；PBST洗膜10 min×3次，置入1:10 000稀释的HRP标记的相应二抗（中杉金桥生物公司）室温孵育30 min，再次PBST洗涤后ECL化学发光法显影、定影，曝光摄片。以β-actin为内参。

1.3.3免疫组织化学染色及结果判定 4 μm厚的石蜡组织切片于65 ℃下烤片30 min，二甲苯脱蜡15 min×2次，梯度乙醇水化，抗原修复，生物标记笔进行组织圈定后滴加3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶活性，PBS浸泡3min×3次；山羊封闭血清室温封闭30 min，加一抗工作液4 ℃过夜；PBS浸泡3 min×3次，滴加即用型二抗，室温孵育1 h；PBS浸泡3 min×3次，DAB显色，复染，脱水，透明，封片，最后将切片置于显微镜下观察并拍照。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：采用双盲法阅片，每张切片选取5个高倍镜视野，根据细胞核阳性显色百分比进行评分[19]。＜5%细胞核显色为0分；5%～30%细胞核显色为1分；31%～50%细胞核显色为2分；＞50细胞核显色为3分。其中，0～1分定义为低表达，2～3分定义为高表达。

1.4　统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。两个样本均数比较采用独立样本t检验，FKBP5蛋白表达与临床病理特征的关系采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，单因素及多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1　FKBP5在HCC组织和癌旁组织中的表达

采用qRT-PCR法检测30例HCC及相应癌旁组织中FKBP5 mRNA表达水平，结果显示，与癌旁组织比较，FKBP5 mRNA在26例HCC组织中呈高表达，占86.7%（26/30）（图1A）。与qRT-PCR结果相似，Western blot结果表明FKBP5蛋白在HCC组织中的表达明显高于相应癌旁组织，典型的Western blot图片见图1B。

为进一步明确FKBP5蛋白在HCC组织中的表达情况，采用免疫组化法检测107例HCC及相应癌旁组织石蜡切片中FKBP5蛋白的表达水平。FKBP5蛋白主要定位于细胞核，且与癌旁组织相比，FKBP5在HCC组织中表达明显增高（图1C-D）。FKBP5蛋白在86.0%（92/107）的HCC组织中有表达，根据免疫组化结果评分标准，将HCC组织标本分为FKBP5高表达组和低表达组。其中高表达组占63.6%（68/107），低表达组占36.4%（39/107）；而癌旁组织中FKBP5高表达者仅有30例（28.0%），其高表达率明显低于HCC组织（P＜0.001）（图1E）。

2.2　FKBP5蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系

分析FKBP5蛋白表达水平与107例HCC患者临床病理特征的关系，结果显示，FKBP5表达水平与肿瘤大小（P=0.009）、数量（P=0.018）、微血管侵犯（P=0.020）、TNM分期（P=0.009）以及BCLC分期（P=0.024）有关，而与患者性别、年龄、AFP、HBsAg、肝硬化、包膜、Edmondson-Steiner分级等无关（均P＞0.05）（表1）。

2.3　FKBP5表达与HCC患者预后的关系

图1　FKBP5在HCC及癌旁组织中的表达检测 A：qRT-PCR检测FKBP5 mRNA表达；B：Western blot检测FKBP5蛋白表达；C：FKBP5在HCC及癌旁组织中的免疫组化染色；D：FKBP5不同表达强度的HCC组织；E：FKBP5在107例HCC及相应癌旁组织中的表达差异比较Figure 1 Determination of FKBP5 expression in HCC tissues and adjacent non-tumorous tissues A: FKBP5 mRNA expression quantified by qRT-PCR; B: FKBP5 protein expression detected Western blot analysis; C: Immunohistochemical staining for FKBP5 expression in HCC and adjacent non-tumorous tissues; D: HCC tissues with different FKBP5 expression levels; E: Comparison of FKBP5 expression levels between HCC tissue and adjacent tissue non-tumorous tissues

采用Kaplan-Meier生存分析探讨FKBP5表达水平与HCC患者预后的关系，结果显示FKBP5高表达及低表达患者的中位生存时间分别为22.0、48.1个月，FKBP5高表达患者1、3、5年总体生存率分别为67.1%、32.0%、14.4%，明显低于FKBP5低表达患者（89.6%、63.3%、40.7%），差异具有统计学意义（P＜0.001）（图2A）。而FKBP5高表达及低表达患者的中位无瘤生存时间分别为15.7 和38.0个月，且FKBP5高表达患者1、3、5年无瘤生存率亦明显低于FKBP5低表达患者（57.6% vs. 76.9%、23.1% vs.51.4%、9.5%vs.32.7%，P＜0.001）（图2B）。

表1　FKBP5表达水平与HCC患者临床病理特征的关系[n（%）]Table 1 Relations of FKBP5 expression with clinicopathologic characteristics of HCC patients [n (%)]

图2　FKBP5不同表达水平的HCC患者生存情况比较 A：总体生存曲线；B：无瘤生存曲线Figure 2 Comparison of survival conditions between HCC patients with different FKBP5 expression levels A: Overall survival curves; B: Disease-free survival curves

2.4　FKBP5高表达是HCC患者总体生存和无瘤生存的独立危险因素

利用Cox比例风险模型进行单、多因素分析，结果显示FKBP5高表达的HCC患者死亡（HR=1.992，95% CI=1.127～3.522，P=0.018）或复发（HR=1.787，95% CI=1.067～2.992，P=0.027）风险明显高于FKBP5低表达患者；且FKBP5高表达与肝硬化、肿瘤个数、微血管侵犯既是HCC患者总体生存的独立危险因素，也是术后无瘤生存的独立危险因素（均P＜0.05）（表2）。

表2　HCC患者总体生存和无瘤生存的影响因素分析Table 2 Analysis of influential factors for overall survival and disease-free survival of HCC patients

3　讨 论

FKBP5是一个大小为51 kDa的FK506结合蛋白，属于亲免素家族，参与调节多种生理和病理过程。近年来，其在肿瘤发生发展过程中的作用日益受到关注。FKBP5在前列腺癌中能够调节雄激素受体活性，进而促进前列腺癌发生发展[14]。在黑色素细胞瘤中，FKBP5呈高表达，且与细胞生存、化疗耐药密切相关[20-21]。同时，FKBP5能够激活EMT相关基因，维持黑色素瘤细胞干性特征，促进肿瘤细胞血管生成和转移[13,22]。Jiang等[17]研究发现FKBP5在神经胶质瘤中表达上调，且与肿瘤分级及预后密切相关，并且FKBP5可通过激活NF-κB通路促进胶质瘤细胞增殖和化疗耐药。此外，食管癌中FKBP5亦呈高表达，且提示患者预后较差[16]。以上研究结果均提示FKBP5是一个癌基因。但Pei等[18]发现FKBP5在胰腺癌标本中表达下调，并导致Akt磷酸化增加，从而降低基因毒应激导致的细胞死亡。在胰腺癌移植瘤模型中敲除FKBP5可促进肿瘤生长，增强肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性[23]。然而，目前FKBP5在HCC中的表达情况及临床意义尚不清楚。

本研究首先采用qRT-PCR法检测30例新鲜HCC标本及相应癌旁组织中FKBP5 mRNA表达水平，结果发现HCC组织中FKBP5 mRNA表达水平较配对癌旁组织明显上调。随后Western blot结果亦证实，与癌旁组织相比，HCC组织中FKBP5蛋白表达水平显著增高。进一步采用免疫组织化学法检测发现， FKBP5蛋白主要定位于细胞核，其在HCC组织中的染色强度明显增高。这些研究结果表明FKBP5在HCC组织中表达上调，提示其可能参与HCC的发生发展过程，并发挥促癌作用。这与FKBP5在黑色素瘤、前列腺癌、食管腺癌、神经胶质瘤中的研究结果相吻合[13-17]。

为明确FKBP5在HCC中的临床意义，进一步分析了FKBP5表达水平与HCC患者临床病理特征的关系。结果显示，FKBP5高表达与肿瘤大小、个数、微血管侵犯、TNM分期及BCLC分期均有关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、AFP、HBsAg、肝硬化、包膜、Edmondson-Steiner分级等无关（均P＞0.05）。既往研究[17,20]显示，FKBP5具有抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖的作用。而本研究发现FKBP5高表达与肿瘤大小密切相关，肿瘤直径≤5cm组FKBP5高表达所占比例显著高于肿瘤直径（71.6% vs.45.5%，P=0.009），间接表明FKBP5可能具有促进HCC细胞增殖的作用。肿瘤个数、微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期在一定程度上可反映肿瘤的侵袭转移潜能[3,24]，FKBP5与以上临床病理特征具有显著相关性，提示FKBP5具有促进HCC细胞侵袭转移的作用。这与Romano等[13,22]在黑色素瘤中发现FKBP5具有促进黑色素瘤细胞侵袭转移的作用相一致，但FKBP5在HCC细胞中的具体生物学作用尚需相关功能实验验证。

本研究重要的发现还包括FKBP5对HCC患者预后的预测价值。Kaplan-Meier法分析显示FKBP5高表达患者的总体生存率和无瘤生存率较低表达FKBP5患者显著降低。Cox回归单因素分析表明FKBP5表达水平与患者总体生存和无瘤生存密切有关。多因素分析进一步证实FKBP5高表达是HCC患者术后总体生存和无瘤生存的独立危险因素。这与Smith等[16]在食管腺癌中的研究结果具有相似性。基于以上结果，FKBP5的表达水平可用作预测HCC患者预后的分子标志物，FKBP5高表达提示患者的预后较差，术后复发风险高。

综上所述，本研究首次证实FKBP5在HCC组织中表达上调，且与HCC患者临床病理特征及不良预后显著相关，提示FKBP5在HCC的发生发展过程中发挥重要作用，可作为HCC患者预后的独立预测指标。后续细胞学和分子生物学研究将有助于揭开FKBP5促进HCC进展的具体作用及机制。

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