BTB/POZ结构域蛋白7假基因1在肝细胞癌中的表达及功能的初步研究

陶一明，胡宽，汤参娥，冯铁诚，王志明

（中南大学湘雅医院 1． 肝脏外科 2． 医学科学研究中心，湖南 长沙 410008）

BTB/POZ结构域蛋白7（BTB/POZ domaincontaining protein 7，BTBD7）基因定位染色体14q32.12，是迄今发现的一个新的癌基因，具有调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化和肿瘤血管塑形的潜在重要功能，是肝细胞癌（HCC）新的上皮间质转化和预后标志物[1]。BTBD7的假基因（pseudogene）1、2（BTBD7P1、BTBD7P2）分别定位染色体10p13和10q25，其序列与BTBD7呈高度同源性，为高度保守的非编码序列，属于长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[2]。近年来研究[3-4]表明，假基因和lncRNA在肿瘤中存在异常表达，并且在肿瘤发生过程中有重要的调控作用。笔者通过实时定量RT-PCR检测HCC患者组织标本发现BTBD7P2在HCC组织中少见表达，BTBD7P1在HCC组织中表达水平显著下调，通过其表达水平与HCC临床病理特征及预后的相关性分析，BTBD7P1可能在HCC发生发展中起重要作用。通过构建BTBD7P1的慢病毒过表达载体，转染HCC细胞系Bel7404，检测转染对细胞BTBD7 mRNA、蛋白水平以及细胞增殖的影响。旨在为研究发现HCC发生发展相关新基因提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　HCC组织标本

HCC组织样本共106例，为2009—2010年间于中南大学湘雅医院肝脏外科行手术切除的HCC患者，均已被告知并签署书面知情同意书。本课题研究内容已报中南大学湘雅医院医学伦理委员会审批备案，同意实施。HCC确诊根据2010年版世界卫生组织（WHO）病理诊断标准。

1.2　细胞系和细胞培养

HCC细胞系Bel7404购自美国保藏物中心（ATCC），生长于含体积分数为10%小牛血清、青霉素（10万U/L）和链霉素（10万U/L）的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱孵育。

1.3　SYBR荧光染料法定量PCR

PCR引物碱基对序列采用美国哈佛大学引物数据库Primer Bank（http://pga.mgh. harvard.edu/primer bank）在线设计，扩增产物约100～250 bp大小，经Blast程序比对确定引物的特异性后，由大连TaKaRa生物技术公司合成。取TRIzol®Reagent（美国Thermo公司）提取新鲜HCC组织总RNA，测定浓度后合成cDNA 用于PCR扩增，用△△Ct以来计量表示该样本中目的基因的表达水平。反应体系和扩增条件参照文献。目的基因序列见表1。

1.4　慢病毒载体pLKO.1-BTBD7P1过表达质粒构建

由上海吉凯生物技术公司完成，根据BTBD7P1基因序列，合成其基因过表达序列；重组病毒包装、收集和病毒浓缩液滴度检测具体方法参照文献。得到病毒浓缩液，检测滴度约为1×109TU/mL。分装后-80 ℃冻存备用。

表1　定量PCR扩增基因序列Table 2 Oligonucleotide sequences of specific primers for quantitative real-time PCR

1.5　慢病毒质粒转染Bel7404细胞

选择Bel7404细胞为转染靶细胞[1]。分为两组：⑴ 转染LV-BTBD7P1的Bel7404细胞组（Bel7404LV-BTBD7P1）；⑵ 转染空载体的Bel7404细胞（Bel7404LV-Control）作为对照组。转染条件和实验操作步骤参照文献[5]。

1.6　MTT法检测Bel7404细胞增殖抑制率

Bel7404细胞转染BTBD7P1过表达质粒和空载体后观察细胞数目，实验操作步骤参照文献[1]。每个实验重复3次取平均值。

1.7　Western blot检测BTBD7的表达

胰酶消化离心转染后的Bel7404细胞，4 ℃预冷的PBS洗涤，800 r/min，离心2次收集细胞，RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，检测蛋白质浓度。电泳、转膜、封闭液实验操作步骤参照文献。BTBD7抗体工作浓度为1:1 000。Bio-Rad Scan软件计算条带的灰度值和内参α-tubulin灰度值的作为蛋白表达量。每个实验重复3次取平均值。

图1　定量PCR检测BTBD7P1与BTBD7P2的表达Figure 1 BTBD7P1 and BTBD7P2 expressions detected by real time PCR

1.8　统计学处理

2　结 果

2.1　HCC组织中BTBD7P1 mRNA表达水平下调

106例配对HCC组织中BTBD7P1 mRNA的表达水平明显低于邻近癌旁肝组织中的表达水平[（0.71±0.16） vs.（ 2.14±1.44），P＜0.05]；HCC组织及癌旁肝组织中少见BTBD7P2 mRNA表达（图1）。

2.2　BTBD7P1表达与HCC临床病理特征的关系

根据癌组织中BTBD7P1相对表达量低于癌旁肝组织2倍为标准分为低表达和高表达。BTBD7P1低表达与肿瘤大小、卫星灶、分化程度、静脉血管侵犯、出血坏死和HCC分期有关（均P＜0.05）（表2）。

2.3　BTBD7P1 mRNA表达与HCC预后的关系

本组BTBD7P1 mRNA高表达患者1、3、5年总体生存率分别为93%、74%、53%，BTBD7P1 mRNA低表达患者1、3、5年总体生存率分别为77%、44%、18%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；BTBD7P1 mRNA高表达患者1、3、5年无瘤生存率分别为74%、57%、38%，BTBD7P1 mRNA低表达患者1、3、5年无瘤生存率分别为22%、12%、5%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

表2　BTBD7P1 mRNA表达与HCC临床病理特征相的关系[n（%）]Table 2 Relations of BTBD7P1 mRNA expression with clinicopathologic characteristics of HCC [n (%)]

图2　不同BTBD7P1 mRNA表达水平患者生存情况比较 A：总体生存曲线；B：无瘤生存曲线Figure 2 Comparison of the survival conditions between patients with different BTBD7P1 mRNA expression levels A: Overall survival curves; B: Tumor-free survival curves

2.4　过表达BTBD7P1抑制HCC细胞增殖

活细胞计数检测Bel7404细胞增殖的变化（图3）。转染LV-BTBD7P1的Bel7404细胞组（Bel7404LV-BTBD7P1）与对照组细胞（Bel7404LV-Control）比较，细胞数明显减少（P＜0.05）。

2.5　BTBD7P1抑制HCC细胞的BTBD7 mRNA表达

通过RT-PCR方法检测Bel7404LV-BTBD7P1和Bel7404LV-Control细胞中BTBD7 mRNA表达水平，结果显示，Bel7404LV-BTBD7P1细胞中BTBD7 mRNA表达水平较Bel7404LV-Control细胞明显下调（P＜0.05）（图4）。通过Western blot检测两组细胞中BTBD7蛋白表达变化，结果显示，两组细胞BTBD7蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）（图5）。

图3　MTT检测结果Figure 3 Results of MTT assay

图4　BTBD7 mRNA表达检测Figure 4 Measurement of BTBD7 mRNA expression

图5　BTBD7蛋白表达检测Figure 5 Measurement of BTBD7 protein expression

3　讨 论

HCC是我国常见恶性肿瘤之一。进一步探索研究新基因的功能与HCC发生发展的关系，对揭示HCC发生、发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，进一步提高我国HCC的治疗水平具有重要意义。

BTBD7基因是近年来新发现的一种上皮间质转化调控关键基因，定位于人类染色体14q32.12区域，约1 233 bp大小，其结构中包括BTB/POZ结构域，CAAT增强蛋白β（C/EBP-β），GATA和AP-1转录子位点[6]。BTBD7首次被发现是因其可引导上皮细胞发生“分支形态”（branching morphogenesis）改变过程中发挥了重要作用[7]。已有的研究[8]显示，BTBD7基因也称FUP1，最先是从肝脏细胞中克隆发现被鉴定，其在肝脏组织表达有相对特异性，并被证实在HCC细胞系中表达上调。笔者[1]前期研究中证实：BTBD7表达诱导HCC细胞发生上皮间质转化表型，并激活下游RhoC-ROCK2-FAK通路信号，促使HCC细胞分泌较多的基质金属蛋白酶2/9（MMP-2/9）。目前调控BTBD7表达研究鲜见报道。

新近研究[9]表明，假基因异常表达可能在肿瘤发生中起重要作用。部分假基因对其功能基因有调节作用[10]。而且特异性假基因表达可作为肿瘤的预测因子，诸如AOC4P[11]、OCT4[12]、INTS6P1[13]等。目前关于BTBD7假基因（BTBD7P1和BTBD7P2）在HCC及其他恶性肿瘤发生发展关系未见报道。本研究结果显示，在HCC患者组织中的BTBD7P1表达水平显著低于癌旁组织，临床病理相关性分析发现BTBD7P1低表达水平与HCC的侵袭转移及预后密切相关，提示BTBD7P1的表达水平与HCC的发生可能存在一定关系。目前BTBD7P1在HCC表达下调的原因尚不清楚，可能涉及缺氧微环境的调节[14]或表观遗传调控机制[15]。

本研究发现BTBD7P1可抑制亲本基因BTBD7 mRNA的表达，但对BTBD7蛋白表达无影响，提示BTBD7P1可能扮演了内源性小RNA（esiRNA）[16]或内源性竞争环状RNA（ceRNA）重要角色[17]。BTBD7P1具有与亲本功能基因BTBD7编码的蛋白质一样的功能，即抑制HCC细胞生长。说明BTBD7P1不需要通过BTBD7蛋白发挥作用，但具体调控机理尚有待进一步探索。已有研究证据表明，假基因可通过竞争性地结合miRNA调控功能基因的表达，从而抑制或者促进肿瘤的发生发展[18]。提示上述作用分子机制可能是BTBD7 mRNA及BTBD7P1转录产物竞争某同一种或几种microRNA，激活不同信号通路发挥功能得以实现，其中哪些是起决定性因素的microRNA调节或者可能参与的信号途径值得进一步深入研究[19-20]。

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