尖孢镰刀菌拮抗菌SN06的分离、鉴定及其对棉花枯萎病的防治效果

李玉洋+辛寒晓+范学明+刘丽英+孙中涛

摘要：采用平板稀释法从棉花根际土壤中分离获得菌株，以尖孢镰刀菌为指示菌采用平板对峙法筛选拮抗菌，通过形态特征、生理生化特征、16S rRNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定，采用平板对峙法研究其抗菌谱，研究其粗提液对温度、pH值和蛋白酶的拮抗稳定性，通过种子萌发及盆栽试验探究其对棉花枯萎病的防治效果。结果表明，分离获得一株对尖孢镰刀菌拮抗作用较强的菌株SN06，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌；菌株SN06抗菌谱广，对多种病原真菌均有一定拮抗作用，且其拮抗作用具有较好的热稳定性、酸碱稳定性与蛋白酶稳定性；接种解淀粉芽孢杆菌SN06可显著降低枯萎病的发病指数，平均防效高达65.19%。解淀粉芽孢杆菌SN06在棉花枯萎病的生物防治方面具有一定的应用价值。

关键词：解淀粉芽孢杆菌；棉花枯萎病；尖孢镰刀菌；生物防治

中图分类号：S435.621文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）03-0117-06

AbstractThe strains were isolated from the rhizosphere soil of cotton by agar plate dilution method. Taking Fusarium oxysporum as the indicator strain， the antagonistic strain was selected by plate confrontation method. Then the antagonistic strain was identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The antibacterial spectrum was studied by the plate dilution method. The antagonism stability to temperature， pH value and protease was verified. The control effect on cotton Fusarium wilt was explored by seed germination and pot experiments. The results showed that strain SN06 exhibited an stronger antagonistic effect on Fusarium oxysporum. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Strain SN06 could inhibit the growth of a variety of pathogens and had a broad antimicrobial spectrum. The strain had good antagonism stability to temperature， pH value and protease. Bacillus amyloliquefaciens SN06 could significantly reduce the disease index of cotton Fusarium wilt with the average control efficiency of 65.19%. Bacillus amyloliquefaciens SN06 had certain application value in the biological control of cotton Fusarium wilt.

KeywordsBacillus amyloliquefaciens； Cotton Fusarium wilt； Fusarium oxysporum； Biological control

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的真菌性病害，在世界各地普遍发生，严重危害棉花生产[1]。该病的致病机制是病原菌侵染棉花维管束等部位，堵塞导管，阻滞水分和养分运输，并产生毒素，影响棉花的新陈代谢，导致死苗、枯叶、落蕾、减产、纤维品质劣变等危害[2]。 目前，棉花枯萎病的防治以化学防治为主，常用药物主要是多菌灵、甲基托布津、百菌清、克黄枯等。化学防治不仅污染环境、危害人畜安全，而且还会使病原菌产生抗药性，降低防治效果[3]。与化学防治相比，生物防治具有专一性强、安全性高、环境友好等优点。因此，筛选对尖孢镰刀菌拮抗作用强的微生物用于棉花枯萎病的生物防治，具有重要意义。很多微生物都对尖孢镰刀菌具有拮抗作用，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等细菌，木霉属真菌（Trichoderma）、丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhize）等真菌，以及细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）等放线菌，其中以木霉对棉花枯萎病的防治效果最好，在生产中应用较多，而芽孢杆菌的应用相对较少[4-9]。但与木霉相比，芽孢杆菌生长快，生产成本低，抗逆性强。因此，筛选高防效芽孢杆菌，用于抗病性生物肥料的生产，对棉花枯萎病的生物防治具有重要意义。本试验从棉花根际土壤中筛选对尖孢镰刀菌拮抗作用强的芽孢杆菌，并对其抗菌谱、拮抗作用稳定性及对棉花枯萎病的防治效果进行研究，以期为抗病性生物肥料的生产提供新的菌种资源。1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试土样供试土样采自山东省泰安、济南、德州、菏泽等地区的棉田，种植棉花品种为鲁棉11。

1.1.2供试病原菌棉花枯萎病菌（F. oxysporum ）、层出镰孢菌（F. proliferatum）、马铃薯灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、白菜炭疽病菌（Colletotrichum higgisianum）、黄瓜黑斑病菌（Alternaria cucumerina），均由山东农业大学微生物工程实验室提供。

1.1.3供试培养基病原真菌培养及拮抗性试验采用PDA培养基；拮抗细菌的分离与菌种保存采用牛肉膏蛋白胨培养基；拮抗细菌的摇瓶培养采用LB培养基；盆栽试验所用尖孢镰刀菌菌剂的制备采用麸皮培养基。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株筛选及抗菌谱测定土壤细菌的分离采用平板稀释法[10]，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上进行培养，长出单菌落后，根据菌落与菌体形态特征初步鉴别不同菌株并转接至斜面，于 4℃保存备用。

拮抗菌株的筛选采用平板对峙法，将从土壤中分离的菌株与尖孢镰刀菌活化后分别进行平板培养。用直径5 mm打孔器在尖孢镰刀菌边缘打取菌块，接种到PDA平板中央。培养3 d后，在距离尖孢镰刀菌菌块2 cm处的4个对接点中3个接种土壤中分离的菌株，另外1个接点不接种菌株作为空白对照，于28℃恒温培养7 d ，测量拮抗细菌菌落直径与抑菌间隙宽度。拮抗效果以抑菌圈与拮抗细菌菌落直径的比值表示，其中：抑菌圈直径=2×抑菌间隙宽度+拮抗菌菌落直径。每处理重复3 次。

抗菌谱的测定采用平板对峙法，方法同上。供试病原菌见表3。

1.2.2拮抗细菌菌株SN06的鉴定拮抗细菌形态特征与生理生化特征的鉴定参照文献[11]进行。将菌株SN06采用稀释涂布平板法接种到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培养 24 h，观察菌落形态，并采用简单染色、革兰氏染色和芽孢染色法观察其细胞形态。将菌株SN06移至吲哚試验培养基、甲基红试验培养基等14种供试培养基上进行培养，鉴定其生理生化特征。

拮抗菌株SN06在LB培养基上进行摇瓶培养，收集菌体，采用 CTAB 法[12]提取总DNA，以其为模板，在原核生物16S rRNA 基因的通用正向引物27F： 5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′的引导下进行PCR 扩增。扩增条件为：95℃ 预变性3 min，94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，共30个循环，72℃延伸 10 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，并采用胶回收试剂盒进行回收，然后委托上海生工生物技术有限公司进行测序。所获得的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，并用MEGA 5.0 软件构建系统发育树，进行多序列同源性分析。

1.2.3粗提液稳定性测定将拮抗细菌菌株SN06接种于LB培养基中，于37℃、200 r/min振荡培养24 h，3 500 r/min离心10 min，上清液采用孔径0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，滤液即为粗提液。

粗提液分别于60、80、90、100、120℃热处理30 min，冷却至室温后，采用牛津杯法[13]测定其对尖孢镰刀菌的拮抗活性，以研究其热稳定性。

用0.5 mol/L NaOH 或 0.5 mol/L HCl分别将粗提液的pH值调至3、5、7、9、11，室温保持1 h，然后再回调至初始pH值，采用牛津杯法测定其对尖孢镰刀菌的拮抗活性，以研究其酸碱稳定性。

粗提液分别采用蛋白酶K、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶进行水解，酶浓度为1 μg/mL，于45℃水解30 min，然后测定其拮抗活性，以研究其对蛋白酶的稳定性。

试验以未经处理的粗提液为对照，其对尖孢镰刀菌的拮抗活性为100%，处理样品的活性定义为与对照活性比值的百分数。

1.2.4 拮抗细菌菌株SN06对棉花种子萌发的影响精选饱满、大小一致的棉花种子，用10%NaClO消毒10 min，用无菌水冲洗干净，然后用粗提液浸泡24 h，以无菌水浸泡24 h为对照。无菌水冲洗干净分装于铺有湿润滤纸的空培养皿中，每个培养皿30粒，每个处理3皿，重复3次。25℃恒温保湿培养，进行发芽试验[14]。

1.2.5棉花盆栽试验将拮抗细菌菌株SN06接种于LB培养基中，于37℃、200 r/min振荡培养24 h，然后采用平板菌落计数法测定有效活菌浓度，并将其调整至1×109 cfu/mL，即为SN06菌剂，4℃保存备用。

将尖孢镰刀菌菌株接种于麸皮培养基中，28℃培养7 d，长满菌丝后于30℃风干，然后粉碎至80目，即为尖孢镰刀菌菌剂。

取健康土壤装盆，按表 1 接种量接种尖孢镰刀菌菌剂和SN06菌剂，进行盆栽试验。尖孢镰刀菌菌剂在栽培前与土壤拌匀，SN06菌剂在播种后随水浇入。棉苗株高至5 cm 时进行疏苗，苗龄为15 d，每盆保留1株，按常规方式进行管理，于播种后40、60、80 d观察记录发病株数。

病情严重度分级如下：0级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级：棉株1～2片子叶变黄萎蔫；2级：棉株2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；3级：棉株2片子叶及 2片及以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状或青枯状，棉株矮化或萎蔫；4级：棉株所有叶片发病，棉株枯死。

病情指数及相对防效按下述公式计算：

病情指数=∑（发病棉花株数×病情级别数）/（棉花总株数×病情最高级别数）×100；

相对防效（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.3数据分析

试验数据分析采用统计软件SPSS 22.0，处理间的差异显著性分析采用Duncan 氏新复极差法。

2结果与分析

2.1拮抗菌株的筛选结果

从土壤中共分离出58株细菌，以尖孢镰刀菌为指示菌，采用平板对峙法筛选拮抗菌，共获得6株拮抗效应较好的菌株，依次命名为SN01—SN06，其抑菌能力如表2所示，其中以SN06的拮抗能力最强，抑菌圈直径和菌落直径比值达2.82，其平板对峙培养图见图1。

2.2拮抗菌株SN06的抑菌谱

拮抗菌株SN06对6种病原菌的拮抗作用如表3所示，该菌株抑菌谱较广，对受试病原菌均具有一定的拮抗作用，但对不同病原菌的拮抗作用差异显著，其中对棉花枯萎病菌的拮抗作用最强，层出镰孢菌与白菜炭疽病菌次之，对马铃薯灰霉病菌、辣椒疫病菌、黄瓜黑斑病菌的拮抗效果较差。

2.3拮抗菌株SN06的鉴定

2.3.1拮抗菌株SN06的形态与生理生化特征拮抗菌株SN06在牛肉膏蛋白胨平板上于37℃培養24 h 后，菌落呈圆形，白色至灰白色，表面湿润，平坦，不透明；菌体呈杆状，产芽孢，芽孢圆形，不膨大，无伴孢晶体；革兰氏染色阳性。其生理生化特征如表4所示。

2.3.216S rDNA 序列分析拮抗菌株SN06的测序结果表明，用16s rDNA通用引物扩增出一条1 425 kb的片断，将其序列利用 BLAST 程序与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA 4.0 软件进行多序列同源性分析，构建系统发育树，如图2所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA 序列分析可知，菌株SN06为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.4粗提液稳定性

拮抗菌株SN06发酵液的粗提液具有较高的热稳定性，在100℃与120℃条件下处理 30 min，拮抗活性仍能保留75%与62%，如图3a所示。生产实践中，菌剂的生产与使用温度一般低于60℃，不会影响粗提液的拮抗能力。粗提液在pH值5～11之间具有稳定的拮抗活性，但在酸性条件下稳定性稍差，在pH值3 时，活性仅能保留65%，如图3b所示。粗提液对蛋白酶具有较高的稳定性，经蛋白酶K、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶于45℃水解30 min后，拮抗活性均能保留75%以上，如图3c所示。

2.5拮抗菌株SN06粗提液对棉花种子萌芽的影响

由表5可知，拮抗菌株SN06 粗提液对棉花种子的发芽率、发芽势、发芽指数均有促进作用，尤其对胚根的生长促进显著（P<0.05）。

2.6棉花盆栽试验结果

棉花盆栽试验结果如表6所示， CK1病情指数为0，而CK2病情指数高达52.45%～65.43%，说明试验所用病原菌对受试棉花具有较强致病性。与CK2相比，接种SN06菌剂的处理发病指数仅为12.42%～28.78%，平均相对防效高达65.19%，说明SN06菌株对棉花枯萎病具有较好的防治效果。盆栽试验还表明，不同栽培时期，SN06菌株对棉花枯萎病的相对防效均较高。此外，还表明随着栽培期的延长，防效有所下降。

3讨论与结论

应用拮抗微生物防治植物病害可以减少化学农药对农业生态环境的污染。本研究从棉花根际土壤中筛选出对棉花枯萎病菌有显著抑制作用的细菌SN06，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌相似度极高的革兰氏阳性菌，繁殖速度快，易培养，有芽孢，环境适应性强，生长繁殖过程中可产生多种具有促生与抑菌作用的代谢产物，是生物肥料生产中应用较为普遍的微生物之一。 本研究结果表明，SN06对6种供试病原菌均有较强的抑菌活性，说明SN06具有高效、广谱性，具有开发生防菌剂的潜能。这与解淀粉芽孢杆菌对枯萎病、疫霉病、灰霉病、菌核病等多种植物病害均有较好的防治效果[15-18]相符合。SN06发酵粗提液具有较好的热稳定性、酸碱稳定性与蛋白酶稳定性，表明SN06不仅可以产生抗菌物质，而且抗菌物质的活性稳定性强。目前研究表明，解淀粉芽孢杆菌主要产生抗菌蛋白、寡肽与脂肽类物质等[15-17]，但具体产生的物质及产生条件还需进一步研究。棉花盆栽试验结果表明，接种解淀粉芽孢杆菌SN06可显著降低棉花枯萎病的病情指数，平均相对防效高达65.19%，与文献[5，19]报道的绿色木霉、枯草芽孢杆菌等对棉花枯萎病的防效相比，处于较高水平。总之，解淀粉芽孢杆菌SN06对棉花枯萎病菌抑菌效果强，在棉花枯萎病的生物防治方面具有一定的应用价值、应用潜力。参考文献：

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