高温对体外培养海马神经元细胞的影响及细胞凋亡机制研究

徐明++张明++张兴国++李侠++白金++尚磊

[摘 要] 目的：研究不同温度对体外培养海马神经元细胞的影响及其机制。方法：取出生1～3天的SD幼鼠海马神经细胞体外培养，分为37℃和42℃2组，分别孵育12h和24h。利用CCK8、TUNEL分析、Western blot等技术，观察12h和24h时海马神经细胞存活率及凋亡细胞数，以及Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表达。结果：与37℃组相比、42℃组海马神经元细胞存活率下降，凋亡阳性细胞数明显增加，并随着时间延长凋亡阳性细胞数增多。42℃组中，神经元细胞Bcl-2表达减弱，Bax、cleaved-caspase3表达增强，上述指标与37℃组同时点比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：高温可以诱导体外培养海马神经元细胞凋亡， 可能通过PI3K/Akt信号传导通路诱导神经细胞凋亡。

[关键词] 高温；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase3

中图分类号：R741.02 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2017）01-082-03

DOI：10.11876/mimt201701033

高温是一种常见职业病危害因素。文献报道长期处于高温环境可引起人记忆力及认知能力下降[1]。海马作为大脑边缘叶的重要组成部分，与认知功能有密切关系，是影响学习和记忆功能的重要脑区[2]。本实验建立高温致体外培养海马神经元细胞凋亡模型，用免疫印迹法对海马神经元细胞的凋亡相关基因 Bcl-2、Bax和活化的caspase3蛋白表达进行半定量观察，探讨高温对海马神经元细胞影响及细胞凋亡发生机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

10只SPF级健康SD乳鼠，出生1～3天，雌雄不限（山东大学动物实验中心）。

1.2 仪器和试剂

二氧化碳培养箱、恒温水浴加热器、mini-PROTEAN电泳装置、DMEM培养基，胎牛血清（购自杭州四季青公司），CCK8试剂盒（碧云天），TUNEL试剂盒（罗氏），DAB显色试剂盒（碧云天），兔Bcl-2一抗、兔Bax一抗、兔cleaved-caspase3一抗（武汉三鹰）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组和处理 海马神经细胞的原代培养采用文献[3]方法。分为2组，每组3个样本，于接种后 6d将盛有细胞悬液的离心管分别置于37℃、42℃恒温水浴箱，2组分别在处理 12h、24h两个时点测定各项指标，测定重复3次，取平均值。

1.3.2 CCK8检测细胞存活率 在96孔板中接种细胞悬液，按上述方法分组培养后，向每孔加入10μL CCK8溶液，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。每组设6个复孔，重复3次。

1.3.3 TUNEL检测细胞凋亡 将细胞接种于含有盖玻片的6孔板内，使细胞爬片。按照上述方法分组培养后，进行固定、洗涤、加反应液、孵育等处理，加入DAB显色液，室温孵育3min镜下观察。单盲法手工计数20个不同视野（200倍显微镜）下TUNEL阳性细胞数，取平均值，计算凋亡细胞百分率。

1.3.4 Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表达 分组处理后，将50μg变性蛋白进行10%SDS -PAGE电泳，转膜上。室温封闭1h，分别加相应一抗及GAPDH内参，4℃摇床孵育过夜。第2天二抗室温孵育1h， ECL反應，经LAS-4000mini型发光成像分析仪曝光显影。用 quantity one 分析软件对各组条带进行分析，将各组的整合灰度比例与内参（ GAPDH） 比较，并以 GAPDH的 ID 为 100% ，得到相对百分数（ 即 ID/内参 ID ×100%） 。

1.4 统计学分析

数据均以均数 ± 标准差（ mean ± SD） 表示，所得数据均采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析。2组之间均数的比较采用单因素方差分析及 Bonferroni 法，以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同温度对海马神经细胞存活率的影响

37℃组12h/24h海马神经细胞平均存活率为99.43%、71.33%，42℃组12h/24h海马神经细胞平均存活率为93.28%、60.88%，42℃组低于同时点37℃组细胞存活率，12h2组间比较P=0.002，24h2组间比较P=0.005，差异均有显著统计学意义。

2.2 不同温度对海马神经细胞凋亡率影响及细胞形态改变

37℃组12h/24h海马神经细胞平均凋亡率为1.23%、5.67%，42℃组12h/24h海马神经细胞平均凋亡率为51.67%、68.36%，42℃组高于同时点37℃组细胞凋亡率，12h2组间比较P=0.0022，24h2组间比较P=0.034，差异均有统计学意义。凋亡细胞镜下可见染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质凝聚、分块，胞质皱缩，核呈圆形或新月形，有的核外周深染而中央淡染（如图1）。

2.3 不同温度对海马神经细胞Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3蛋白表达影响

42℃组12h/24h海马神经细胞Bax表达较37℃同时间点明显增加，12h2组间比较分别是P=0.0395<0.05，24h2组间比较分别是P=0.021<0.05（见图2A）。42℃组Bcl-2蛋白表达下调，12h2组间比较P=0.0086<0.01，24h2组间比较P=0.003<0.01，差异均有显著统计学意义（见图2B）。42℃组12h/24h海马神经细胞cleaved-caspase3蛋白表达较37℃同时间点明显增加，12h2组间比较分别是P=0.0239<0.05，24h2组间比较分别是P=0.0088<0.01（见图2C）。

3 讨论

在一定条件下，高温对人体的损害是不可逆转的，而这些不可逆的损害有可能是通过细胞凋亡实现的[4]。细胞凋亡又称为程序化细胞死亡，是细胞生物有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程[5]。高温诱发细胞凋亡的发生机制，一方面是直接影响细胞结构，另一方面与某些基因异常表达有关。

高温诱导机体细胞损伤程度与热的程度相关，极度高温（49℃～50℃以上）可导致细胞在5min内以坏死方式死亡，而当环境温度在 41.6℃～42℃时，细胞死亡方式以凋亡为主[6]。本实验从细胞形态和相关蛋白变化，观察温度对海马神经细胞的影响。光镜下可见高温改变了神经细胞结构，其中细胞核的改变最具特征性。CCK8、TUNEL结果表明，高温可降低神经细胞存活率，加快凋亡，且温度越高细胞存活率越低，凋亡率越高。随着时间延长，细胞存活率明显下降，细胞凋亡数增多。陈光忠等[7]研究显示，高温处理的大鼠海马锥体细胞，凋亡率增加，且温度越高、时间越长凋亡率越高，结论与本实验结果一致。近年研究显示PI3K/Akt信号转导途径在细胞的存活、增殖、凋亡以及细胞骨架变化等[8]活动中发挥重要的生物学功能，其机制可能包括：①调节Bcl-2家族成员的活性；②抑制caspase家族导致的细胞凋亡；③活化的Akt抑制GSK-3活性，加速凋亡；④活化的Akt抑制线粒体释放如细胞色素C、AIF等凋亡相关因子，抑制凋亡；⑤活化转录因子NF-κB促进细胞增殖，抑制细胞凋亡等。

Bcl-2蛋白家族有抑制细胞凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xl等），有促进细胞凋亡基因（Bax，Bad等）[9-10]。凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路或交汇点受Bcl-2调节。Bcl-2通过干扰细胞色素C自线粒体的释放，阻断caspase蛋白酶连锁反应的激活，进而抑制细胞凋亡[11]。

Caspase家族是细胞凋亡下游关键酶，caspase3是该家族中细胞凋亡的主要效应因子， 与其他的caspases以级联反应方式， 主要作用在细胞凋亡的执行阶段，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶[12-13]。本研究采用Western blot检测蛋白Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的表达情况，结果显示高温能干扰这些蛋白的表达，随着温度升高，Bax、cleaved-caspase3表达增加，Bcl-2表达降低，随着时间延长变化更为明显。表明Bcl-2有保护细胞免受凋亡的作用。Strasser等[14]报道，Bc1-2基因表达可以使热诱导的细胞凋亡下降，并促使细胞继续增殖，形成热耐受。崔宝林[15]等报道，热疗可显著抑制 Bcl-2通路，促进细胞凋亡，与本实验结果相符。随着加热时间延长cleaved-caspase3活性变化与细胞凋亡趋势一致，说明caspase3参与了高温诱导的海马神经细胞凋亡；Lecchi C等[16]发现，随着温度升高，活化后的caspase3表达逐渐增强，其表达趋势与神经元细胞凋亡一致。朱晔晶等[17]报道，热处理人ECV304 后，caspase3随着时间的增加其活性变化与细胞凋亡趋势一致，与本实验结论相符。

综上所述，高温可诱导海马神经细胞凋亡，随着温度的升高及时间的延长，细胞凋亡数增加。Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白是PI3K/Akt信号转导途径中调节蛋白，可能是通过PI3K/Akt信号转导途径诱导神经元细胞凋亡，Akt是该传导通路的下游靶激酶，可进一步观察Akt等相关蛋白明確其在海马神经元细胞损伤中的作用。

参 考 文 献

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