乙型肝炎病毒耐药检测研究进展

李军

[摘 要] 核苷（酸）类似物（NA）是目前临床治疗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染的首选方案，但随着治疗时间的延长，HBV耐药性的产生极易对治疗效果造成影响。HBV耐药性检测包括基因型耐药和表型耐药分析两种手段，其中前者可明确HBV基因组中已知与耐药相关的病毒变异，在近年来病毒耐药性检测领域受到了广泛关注。本文就HBV耐药原因以及DNA直接测序技术、焦磷酸测序技术等十余种基因型耐药检测方案进行综述，旨在为强化HBV耐药管理提供参考。

[关键词] 乙型肝炎病毒；耐药；检测；进展

中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2017）01-025-03

DOI：10.11876/mimt201701010

据世界卫生组织（WHO）统计，目前全球乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染者为3.5亿，其中30%患者已进展至肝硬化阶段，需及时实施长期、有效的抗病毒治疗[1]。干扰素和核苷（酸）类似物（NA）两大类抗病毒药物是目前临床治疗HBV感染的主要药物，其中，NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒复制作用明确等优势，得到了广泛应用[2]。但其缺陷在于，需长期服用方可将HBV抑制在较低水平，降低肝硬化、肝癌等继发疾病发生风险，而长期服用NA可诱导HBV耐药突变的发生，加之近年来低耐药屏障NA序贯应用的逐步推广，HBV多药耐药为临床治疗带来了更为严峻的挑战[3-4]。本文就HBV耐药机制、耐药检测及防治策略进行综述，旨在为HBV耐药的监测与分析提供参考。

1 HBV耐药原因

1.1 HBV耐药机制

缺乏校正的逆转录伴随着HBV复制的全过程，若HBV基因突变位点恰好处于HBV-DNA聚合酶的逆转录区域，则极有可能导致耐药性的产生[5]。应用抗病毒药物治疗前，慢性乙肝患者体内往往并不存在耐药株，均为野生株，但抗病毒药物对HBV的选择性作用，可逐渐导致药物敏感野生株逐渐减少、耐药株获得生存，继而成为优势病种株，最终引发HBV总体耐药性的产生[6]。

1.2 HBV耐药因素

研究表明，药物的空间结构、基因屏障及药代动力学特征均在耐药性的产生环节扮演了重要角色[7]。如拉米夫定与三磷酸脱氧胞苷（dCTP）结构差异明显，但阿德福韦酯与dCTP十分接近，故前者更易发生HBV耐药。Lee等[8]发现，拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定在发生耐药变异时，HBV耐药株仅1个位点发生突变，而恩替卡韦耐药株需在上述突变基础上发生3个位点联合突变，故初治患者恩替卡韦耐药率极低。若抗病毒药物可同时强烈抑制野生株、耐药株复制，则其药代动力学优势可保证HBV处于较低的耐药性。除抗病毒药物自身因素外，患者HBV-DNA定量、病程、年龄、依从性、治疗方案、病情等基础状态亦可对HBV耐药性造成明显影响[9]。

1.3 HBV耐药分类

HBV耐药包括基因耐药、交叉耐药两种类型，其中基因耐药即为HBV基因序列发生耐药相关基因突变，若该基因突变导致病毒株对药物敏感性降至野生株的25%以下，则被称为表型耐药；交叉耐药是指病毒在发生基因耐药的同时，不仅对某一种药物耐药，且同时对另外一种无关药物存在耐药性。目前临床常用抗病毒药物的耐药性分别为：拉米夫定20%～69%，阿德福韦酯11%～29%，恩替卡韦9%，替比福定2%～4%，随用药时间的延长，其耐药性不断增加[10]。

2 HBV耐药检测

2.1 DNA直接测序技术

DNA直接测序技术是最为经典的HBV耐药检测方法，在所有耐药变异检测技术中，DNA直接测序技术的准确性、特异性均处于较高水平，且多数学者均将该技术作为检测其他技术功效的对比标准[11]。但由于该技术耗时久、经济性差、技术落后、检出限高达20%，且易出现混合感染中少量HBV感染的漏检，近年来应用逐渐减少。

2.2 焦磷酸测序技术

焦磷酸测序在DNA直接测序技术的基础上发展而来，是借助DNA合成过程中释放的焦磷酸判断HBV耐药情况的新型酶级联二代测序技术，与过往Sanger法ddNTP参与的链终止反应相比，该技术不需电泳、荧光标记，且分析快速、灵敏度高，可实现自动化定量分析。有学者将该技术用于HBV突变质粒标准品的检测，发现该技术10 min即可完成接近100份样本的检测，且检出限低至4%[12]。但其不足之处在于阅读长度仅为40 bp，覆盖范围有限，故罗氏最新研发的454 GS FLX测序平台在该技术的基础上进一步优化，提供了超深度焦磷酸测序技术，将其阅读长度延伸至250 bp，檢出限进一步升至1%，其高灵敏度、特有基因频率分析功能得到了广泛认可，但同时也大大增加了设备成本以及数据复杂性，临床推广受限[13]。

2.3 拉链核酸检测技术

拉链核酸（ZNA）是一种寡核苷酸，可以拉链形式连接互补核苷酸，故被称为“拉链核酸”，其可被阳离子精胺衍生物单元（Z单元）修饰，进而减少核苷酸链之间负电荷排斥力、提升引物和探针退火温度，在增强双链杂交稳定性及错配识别能力方面具有重要作用[14]。由于ZNA的Tm值仅受Z单元数量、寡核苷酸链长度影响，其探针设计极为简便、灵活。有学者针对HBV YMDD、YVDD、YSDD、YIDD序列设计不同的探针，发现该技术突变病毒载量检测底线可达35 copies/mL，是其他技术检测底线的300倍以上，且其灵敏性、特异性均较高，为野生、突变株的定量比例计算提供了可能，亦可动态监测耐药株比例的实时变化[15]。其缺陷在于，需针对不同位点设计不同ZNA探针，虽然探针设计较为简便，但仍为临床工作者增加了较大的工作量负担。

2.4 AllGlo探针实时荧光PCR技术

目前TaqMan探針、分子信标、杂交探针、双链置换探针等实时PCR探针应用十分广泛，在此基础上，AllGlo探针不仅具有上述探针全部的优点，还具有更高的荧光强度、检测灵敏度、特异性及广泛的可选荧光种类，有学者将AllGlo探针同时用于四种人乳头瘤病毒的单管检测，取得了良好的效果[16]。Kitrinos等[17]设计HBV YMDD、YIDD、YVDD的针对性AllGlo探针，发现其检测限达50 copies/mL，且与直接测序法比较未发现不一致结果，显现出该技术较高的准确性。需要注意的是，AllGlo探针在保持高灵敏度的同时，对靶序列保守性的要求极高，故在突变率较高的HBV耐药性检测方面，适用性不够广泛。

2.5 量子点DNA荧光共振能量转移传感器技术

量子点DNA荧光共振能量转移（QDs-DNA-FRET）技术在单核苷酸多态性、微量DNA的检测中得到了广泛关注，其检测方法仅需3步，分别为连接量子点表面形成功能性QDs-DNA连接体、向连接体内加入报告探针、应用FRET及寡核苷酸连接酶检测反应测定荧光信号。突变型HBV存在的单碱基错配可导致QDs-DNA复合体杂交失败，故无法参与FRET反应，亦无荧光信号产生[18]。其优势在于无须PCR扩增、特异性佳，且具有高效性、快速性，可同时实施多位点检测，同时，检测设备仅需多标记分析仪，易于临床实验室推广。但该技术亦需应用大量配套特殊试剂，是限制其推广的主要原因。

2.6 PCR侵入技术

与其他PCR技术的差别在于，PCR侵入技术不是对目的核酸进行扩增，而是实施探针信号扩增，通过侵入探针、信号探针、靶核酸分子检测和侧翼核酸内切酶3个体系，该技术可迅速分开荧光基团与淬灭基团，其检测下限为10 copies/mL，耐药病毒株检测比例可低至2%，且其对信号DNA进行扩增可大大降低检测过程中造成的污染，具有较强的特异性[19]。该技术的不足之处与ZNA检测技术类似，即需根据不同位点设计对应的侵入探针、信号探针，在一定程度上增加了检测的烦琐度。

2.7 限制性片段长度多态性技术

限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术主要借助DNA限制性内切酶特性，切割已知HBV耐药突变并行PCR扩增，从而区分HBV耐药突变与非HBV耐药突变。其优势在于操作简便、一次性可检测大量突变、灵敏度和特异性均较高，但其优势也同样明显，即对于变异快速的HBV，无法及时制作针对性限制性内切酶，导致检测失败。此外，Ayres等[20]指出，若扩增产物可被限制性内切酶识别，则可能导致目标片段酶活性竞争，影响检测结果。

2.8 基质辅助激光解吸离子飞行质谱技术

基质辅助激光解吸离子飞行质谱（MALDI-TOF-MS）技术是近年来新兴的一种HBV耐药检测技术，其主要分析野生型HBV与变异型HBV间分子量差别，以明确耐药基因突变，其重复性、特异性、灵敏度均较高，但检测限仅为100 copies/mL，不及上述其他技术[21]。

2.9 其他技术

目前实验室明确HBV耐药株的方法多种多样，除上述8种技术外，还存在肽核酸分析技术、基因芯片技术、连接酶检测反应技术、线性探针杂交法、依赖转染细胞模型的表型耐药检测等[22-26]，为DNA直接测序的替代提供了新的方向，但各种技术也或多或少的存在一定缺陷，如肽核酸分析技术的突变株结果难以解释、基因芯片技术成本极高、连接酶检测反应技术检测限偏高、线性探针杂交法易漏检、依赖转染细胞模型仅可明确表型耐药但无法了解基因型耐药等。因此，如何综合上述技术的优势，尽可能寻求一种安全、经济、可靠、简便的检测方案，仍是医学工作者需要继续努力的方向。

3 展望

HBV耐药是乙型肝炎长期治疗中的最大难题，密切检测HBV耐药甚至多重耐药的发生，方为降低严重临床结局发生风险、改善患者预后质量的关键。当前关于抗病毒药物耐药的技术众多，且多数处于起步阶段，适用性、推广性均较为有限，对于各类现象、规律的认知亦不够完善。但各类技术在近几年已取得了飞速的发展，医学工作者亦朝着低成本、高通量技术方向不断努力，未来HBV耐药检测可着力于明确HBV耐药演变，了解HBV耐药发生发展关联。同时，随着耐药突变的早期检出，有望涌现出更多靶标抗病毒药物，为抗病毒治疗方案的个体优化、临床疗效的提升、患者预后的改善及HBV耐药株的减少提供更多可能性。

参 考 文 献

[1] Zoulim F， Locarnini S. Optimal management of chronic hepatitis B patients with treatment failure and antiviral drug resistance[J]. Liver Int， 2013， 33（s1）： 116-124.

[2] Baxa D M， Thekdi A D， Golembieski A， et al. Evaluation of anti-HBV drug resistant mutations among patients with acute symptomatic hepatitis B in the United States[J]. J Hepatol， 2013， 58（2）： 212-216.

[3] Aoudjane S， Chaponda M， del Castillo A A G， et al. Hepatitis B virus sub-genotype A1 infection is characterized by high replication levels and rapid emergence of drug resistance in HIV-positive adults receiving first-line antiretroviral therapy in Malawi[J]. Clin Infect Dis， 2014， 59（11）： 1618-1626.

[4] 李晨，游紹莉，刘鸿凌，等.老年HBV相关慢加急性肝衰竭患者临床特点及其近期预后危险因素的研究[J].中华保健医学杂志，2015，17（2）：108-112.

[5] Margeridon-Thermet S， Svarovskaia E S， Babrzadeh F， et al. Low-level persistence of drug resistance mutations in hepatitis B virus-infected subjects with a past history of Lamivudine treatment[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013， 57（1）： 343-349.

[6] Tana M M， Ghany M G. Hepatitis B virus treatment： Management of antiviral drug resistance[J]. Clin Liver Dis， 2013， 2（1）： 24-28.

[7] Ahn S H， Park Y K， Park E S， et al. The impact of the hepatitis B virus polymerase rtA181T mutation on replication and drug resistance is potentially affected by overlapping changes in surface gene[J]. J Virol， 2014， 88（12）： 6805-6818.

[8] Lee G H， Inoue M， Toh J K P， et al. Two-step evolution of the hepatitis B drug-resistant mutations in a patient who developed primary entecavir resistance[J]. Liver Int， 2013， 33（4）： 642-646.

[9] Hosaka T， Suzuki F， Kobayashi M， et al. Long-term entecavir treatment reduces hepatocellular carcinoma incidence in patients with hepatitis B virus infection[J]. Hepatology， 2013， 58（1）： 98-107.

[10] Salpini R， Alteri C， Cento V， et al. Snapshot on drug-resistance rate and profiles in patients with chronic hepatitis B receiving nucleos （t） ide analogues in clinical practice[J]. J Med Virol， 2013， 85（6）： 996-1004.

[11] Morando F， Rosi S， Fasolato S， et al. Severe acute hepatitis B in a treatment-na?ve patient with antiviral drug resistant mutations in the polymerase gene[J]. J Med Virol， 2013， 85（2）： 210-213.

[12] Gomes-Gouvêa M S， Ferreira A C， Teixeira R， et al. HBV carrying drug-resistance mutations in chronically infected treatment-naive patients[J]. Antivir Ther， 2015， 20（4）： 387-395.

[13] Rybicka M， Stalke P， Dreczewski M， et al. High-Throughput Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative Approach to Monitoring Drug Resistance of Hepatitis B Virus[J]. J Clin Microbiol， 2014， 52（1）： 9-14.

[14] Panigrahi R， Biswas A， De B K， et al. Characterization of antiviral resistance mutations among the Eastern Indian Hepatitis B virus infected population[J]. Virol J， 2013， 10（1）： 1.

[15] Han Y， Zhang Y， Mei Y， et al. Analysis of hepatitis B virus genotyping and drug resistance gene mutations based on massively parallel sequencing[J]. J Virol Methods， 2013， 193（2）： 341-347.

[16] Basaras M， Arrese E， Blanco S， et al. Comparison of INNO-LIPA and TRUGENE assays for genotyping and drug-resistance mutations in chronic hepatitis B virus infection[J]. Intervirology， 2013， 56（3）： 190-194.

[17] Kitrinos K M， Corsa A， Liu Y， et al. No detectable resistance to tenofovir disoproxil fumarate after 6 years of therapy in patients with chronic hepatitis B[J]. Hepatology， 2014， 59（2）： 434-442.

[18] Reddy K R， Beavers K L， Hammond S P， et al. American Gastroenterological Association Institute guideline on the prevention and treatment of hepatitis B virus reactivation during immunosuppressive drug therapy[J]. Gastroenterology， 2015， 148（1）： 215-219.

[19] Lim Y S， Yoo B C， Byun K S， et al. Tenofovir monotherapy versus tenofovir and entecavir combination therapy in adefovir-resistant chronic hepatitis B patients with multiple drug failure： results of a randomised trial[J]. Gut， 2016， 65（6）： 1042-1051.

[20] Ayres A， Yuen L， Jackson K M， et al. Short duration of lamivudine for the prevention of hepatitis B virus transmission in pregnancy： lack of potency and selection of resistance mutations[J]. Journal of viral hepatitis， 2014， 21（11）： 809-817.

[21] Bang K B， Kim H J. Management of antiviral drug resistance in chronic hepatitis B[J]. World J Gastroentero， 2014， 20（33）： 11641-11649.

[22] Neumann-Fraune M， Beggel B， Pfister H， et al. High frequency of complex mutational patterns in lamivudine resistant hepatitis B virus isolates[J]. J Med Virol， 2013， 85（5）： 775-779.

[23] Lim Y S， Byun K S， Yoo B C， et al. Tenofovir monotherapy versus tenofovir and entecavir combination therapy in patients with entecavir-resistant chronic hepatitis B with multiple drug failure： results of a randomised trial[J]. Gut， 2016， 65（5）： 852-860.

[24] Ho E Y， Yau T， Rousseau F， et al. Preemptive adefovir versus lamivudine for prevention of hepatitis B reactivation in chronic hepatitis B patients undergoing chemotherapy[J]. Hepatol Int， 2015， 9（2）： 224-230.

[25] Rodriguez C， Chevaliez S， Bensadoun P， et al. Characterization of the dynamics of hepatitis B virus resistance to adefovir by ultra-deep pyrosequencing[J]. Hepatology， 2013， 58（3）： 890-901.

[26] VOLZ T， ALLWEISS L， ?BAREK MB， et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus[J]. J Hepatol， 2013， 58（5）： 861-867.