黄芪发酵菌的筛选鉴定及纤维素酶学性质试验

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161006)

黄芪发酵菌的筛选鉴定及纤维素酶学性质试验

王岩，刘宇，侯美如，尹珺伊，朱庆贺，秦平伟，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161006)

为分离发酵黄芪菌株，试验采取黄芪样品接种营养琼脂，置30℃环境培养。取分离菌接种纤维素刚果红琼脂，筛选能形成较大降解圈的细菌进行鉴定，并测定其纤维素酶性质。结果表明，筛选菌为解淀粉芽孢杆菌，该菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为4.03。在37℃环境培养36 h酶活力达到高峰，为32.16 U/mL。在低于60℃及pH值6.0～8.0环境纤维素酶较稳定，可保持酶活力90%以上。

黄芪;中药发酵;纤维素酶;解淀粉芽孢杆菌

现代中药发酵技术是结合现代生物工程学、微生态学、发酵工程学等学科技术，在中药传统发酵炮制方法的基础上发展形成的现代中药制药新技术。中草药细胞壁是由纤维素、半纤维素和木质素等成分构成的致密结构，有效成分大多包裹在细胞壁内。应用煎煮等传统方法提取中药时，胞内有效成分向提取介质中扩散需要克服细胞壁及细胞间质的双重阻力，有效成分不易游离至提取介质中。应用降解纤维素的微生物发酵中药，微生物分泌的纤维素酶可裂解细胞壁纤维，有利于中药有效成分向胞外释放，提高中药的提取率［1］。

源于细菌的纤维素酶不仅具有耐碱、耐热等优良特性，而且细菌生长周期短，发酵工艺简单，易于控制，因此产纤维素酶细菌研究广受重视［2－3］。由于产纤维素酶芽孢杆菌具有抗逆性强、易于产业化等优点，因而更具应用前景。本试验从黄芪样品中分离筛选出1株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌，并测定了酶学特性，以期用于黄芪的生物发酵。

1 材料与方法

1．1 药材与试剂黄芪，购自河北凯达药业有限公司;TaKaRa Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver．3．0、EX Taq酶和dNTP，均购自大连宝生物工程有限公司;Marker DL－2000，购自Genstar公司;琼脂糖，购自OXOID公司。

1．2 培养基黄芪琼脂:黄芪粉100 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，牛肉汤1 000 mL，pH值7.2。发酵培养基:羧甲基纤维素钠10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7．2。

1．3 DNS试剂参照文献［4－5］，称取3，5－二硝基水杨酸6．3 g溶于约700 mL蒸馏水中，然后加入0.2 g/mL氢氧化钠溶液100 mL，搅拌均匀，依次加入四水酒石酸钾钠182 g、苯酚5 g、无水硫酸钠5 g，溶解后用蒸馏水定容至1 000 mL。

1．4 黄芪发酵菌筛选取黄芪样品接种营养琼脂，置30℃环境培养。取生长菌接种黄芪琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，置30℃环境培养，筛选能在黄芪琼脂生长，并在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌。测量筛选菌水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)，初步判定筛选菌降解纤维素的活力［6－7］。

1．5 分子生物学鉴定按DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA。应用细菌通用引物扩增16S rRNA，P1:5'－GAGCGGATAACAATTTCACACAGG－3'; P2:5'－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC－3'。PCR反应体系50 μL，其中TaqDNA聚合酶0．5 μL、10×PCR reaction Buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，dNTP为1 μL，上下游引物各2 μL，去离子水补至50 μL。扩增条件:94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火复性40 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10 min。扩增产物于0．8%琼脂糖凝胶检测后测序。利用NCBI－BLAST搜索程序从GenBank进行同源性检索，并构建系统进化树。

1．6 葡萄糖标准曲线绘制取试管分别加入1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再依次加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，然后各管加DNS试剂2 mL，置沸水浴5 min。以对照调零，于490 nm处测定各管OD值。以标准葡萄糖溶液的葡萄糖含量(mg)为横坐标，以OD值为纵坐标，作葡萄糖标准曲线。

1．7 纤维素酶学性质测定

1．7．1 产酶曲线测定参照文献［7－12］方法测定酶活力。在菌株发酵培养18～72 h，每隔6 h取样1次，测定发酵液中纤维素酶酶活力。以时间为横轴，以纤维素酶活力为纵轴绘制曲线，即得该菌产酶曲线。

1．7．2 热稳定性测定取试管分别加入发酵液3 mL，试验管分别置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃环境，对照管置室温环境，作用1 h后测定相对酶活力，纤维素酶稳定性以存余酶活力与对照酶活力的百分率表示。

1．7．3 酸碱稳定性测定取试管分别加入发酵液3 mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠分别调各管发酵液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，对照管不作处理，置30℃环境作用1 h，各管用柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液调至9 mL，然后测定相对酶活力，计算剩余酶活力的百分率。

2 结果与分析

2．1 菌株筛选结果从黄芪样品中筛选出1株能在黄芪琼脂生长，且在刚果红琼脂形成较大降解圈的细菌，菌株H/C为4.03，据此判断该菌株降解纤维能力较强。

2.2 PCR扩增及系统进化树分析以菌株总DNA为模板，采用16S rRNA引物P1、P2进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增获得目的片段约500 bp，结果如图1。

图1 目的基因PCR扩增结果M:DL－2 000DNA Marker;1、2:PCR产物;3:阴性对照

扩增序列长度为574 bp，经BLAST与GenBank数据库序列比对，该序列与解淀粉芽孢杆菌IHBB2284及MD33同源性达100%。同时构建系统进化树，见图2。结果表明，筛选菌株与解淀粉芽孢杆菌IHB B2284株及MD33株在同一分支中，确定该菌为解淀粉芽孢杆菌，并命名为解淀粉芽孢杆菌SSY1株。

图2 菌株16S rRNA基因系统进化树

2．3 葡萄糖标准曲线依据不同含量葡萄糖溶液在波长490 nm处测定的OD值，得回归方程y= 0.8651x－0．0323，相关系数R2=0.9992，葡萄糖标准曲线见图3。

2．4 酶学性质

2．4．1 不同培养时间纤维素酶活力不同培养时间发酵液的纤维素酶活力曲线见图4。在菌株发酵培养36 h纤维素酶活力达到最大值，为32.16 U/mL，此后至培养72 h，纤维素酶活力呈平稳波动状态。见图4。

图3 葡萄糖标准曲线

图4 酶活力测定结果

2．4．2 纤维素酶热稳定性将发酵液分别置不同温度环境作用1h，酶活力测定结果见图5。在低于60℃环境中纤维素酶较为稳定，酶活力均维持在最高酶活力的90%以上。当温度高于60℃时纤维素酶活力失活加剧，当温度为80℃时，纤维素酶活力下降至最高酶活的30%以下。

图5 热稳定性测定结果

2．4．3 纤维素酶酸碱稳定性将发酵液分别置不同酸碱度的环境中作用1h，酶活力测定结果见图6。纤维素酶力在pH值7．0最稳定，相对酶活力为99.51%，在pH值6.0～8.0环境纤维素酶具有较好稳定性，相对酶活力保持在90%以上，在pH值3.0环境最不稳定，相对酶活力仅为22.15%。

图6 酸碱稳定性测定结果

3 讨论

中药生物发酵是现代中药炮制领域的研究热点，选育优良发酵菌种是发酵中药的技术关键。目前用于发酵黄芪的菌种主要有保加利亚乳杆菌、乳酸菌、香菇真菌、灵芝真菌、伞枝犁头霉菌和糙皮侧耳菌等［14－15］。本试验从黄芪样品中分离出一株具有降解纤维能力，能在黄芪培养基生长的细菌，经形态及分子生物学鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌株营养要求低，适应性强，安全性良好，有望作为发酵黄芪的候选菌株。

DNS方法是测定纤维素酶活力的常用方法，具有操作简便，精确度较高等优点，但易受酶力和底物浓度等条件的影响［1，9］。本试验分离的解淀粉芽孢杆菌所产纤维素酶活力为32.16 U/mL，与李红亚等［16］报道的解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力45.4 U/g较近，而远低于崔海洋等［17］报道的解淀粉芽孢杆菌菌株所产纤维素酶活力307.23 U/mL，以及王凯等［18］报道的纤维素酶酶活力135.8 U/mL。由于DNS方法中纤维素浓度、反应体系加量，以及测定波长的差异性，因此各学者测定的结果可比性也不强。依据筛选菌在刚果红培养基形成的降解圈，初步判断该菌株具有中等降解纤维素活力［6－7，18］。

目前，用于发酵中药的菌种主要为细菌和食用真菌，本试验分离的解淀粉芽孢杆菌在室温条件下能在含黄芪的培养基上正常生长，且安全性良好，这为应用本菌发酵黄芪奠定了一定的技术基础。

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Study on Screening and Identification of a strain for fermentation of Radix Astragalus and its Enzymic Characters

WANG Yan，LIU Yu，HOU Mei-ru，YIN Jun-yi，ZHU Qing-he，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui
(Heilongjiang Institute of Veterinary Medicine Science，Qiqihaer 161006，China)

In order to isolate the strains which have fermenting performance for Radix Astragalus，the Radix Astragali samples were inoculated on nutrient agar medium and cultivation at 30℃，and then the isolating strains were inoculated on the cellulose-congo red agar，Screening the bacteria which can form a larger cellulose-decomposing zone to identification based on molecular biological method was performed，and the activity of the cellulose was determined．The results showed that the isolated strain was identified as Bacillus amyloliq-uefaciens，and the ratio of H/C was 4.03．The highest cellulase activity reached 32.16 U/mL when cultivated at 37℃for 36 h．The cellulase activity was stable at temperatures lower than 60℃and at pH range of 6.0－8．0，which retained more than 90%．

Radix Astragalus;Fermentation of Chinese herbal medicine;Cellulase;Bacillus amyloliquefaciens

SHI Tong-rui

A

0529-6005(2017)01-0100-03

2015-07-21

黑龙江科技计划项目(GC13B404)

王岩(1976－)，女，高级兽医师，本科，从事微生态制剂研发工作，E-mail:wangyan200705@sina．com

史同瑞，E-mail:systr@sina．com