电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响*

李洪涛，刘 昊，杨方军，李艳秋，孙晓伟△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040; 3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001)

电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响*

李洪涛1，2，刘 昊1，杨方军3，李艳秋2，孙晓伟1，2△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040; 3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001)

目的:观察电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨内Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响。方法:32只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、DKK1组和电针组，用4%木瓜蛋白酶诱导大鼠膝关节骨性关节炎模型，分别于造模成功后5周和7周取材，观察大鼠膝关节软骨形态变化以及Western Blot法检测大鼠关节软骨中Wnt3a、β-catenin含量的变化。结果:正常组大鼠在5周和7周时，关节软骨内Wnt3a蛋白呈低表达，分别为0.233±0.04和0.193±0.03;而各造模组大鼠，在这两个时间点，关节软骨内Wnt3a蛋白含量均有不同程度的升高，其中电针组、DKK1组均较模型组有所降低，且具有统计学意义(P＜0.05)，而此两组间比较无差异(P＞0.05)。正常组大鼠在5周和7周时，关节软骨内β-catenin蛋白呈低表达，分别为0.163±0.04和0.143±0.03;而各造模组大鼠，在这两个时间点，关节软骨内β-catenin蛋白含量均有不同程度的升高，其中电针组、DKK1组均较模型组有所降低，且具有统计学意义(P＜0.05)，而此两组间比较无差异(P＞0.05)。结论:电针可能是通过下调Wnt3a、β-catenin蛋白表达、抑制Wnt信号通路，进而保护受损的关节软骨，改善膝关节骨性关节炎大鼠的关节结构和功能状态。

膝关节骨性关节炎;针刺;Wnt3a蛋白;β-catenin蛋白;Wnt信号通路

膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种慢性膝骨关节退行性疾病，以膝关节软骨变性和退行性病变为主，伴有膝关节的疼痛、肿胀、变形以及活动障碍等症状。在此病变过程中，膝骨关节内的滑膜、软骨等内在组织也参与骨性关节炎的病理生理变化过程，严重影响了患者日常生活活动和生活质量［1-2］。近年来，部分学者通过实验证实，软骨细胞的增殖、分化、成熟、凋亡参与了KOA病理改变的过程，同时也对这一过程起到重要作用。而Wnt信号通路参与了软骨的发育、形成以及受损后修复，并且调节软骨细胞周期性变化和代谢过程［3-4］。本实验通过4%木瓜蛋白酶诱导膝骨性关节炎大鼠模型，研究电针对关节软骨内Wnt信号通路的关键因子Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响，目的是从分子水平探讨电针对膝骨性关节炎的保护作用及可能的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

符合国家二级动物标准雄性健康清洁级SD大鼠［哈尔滨市兽医研究所，质量合格证书号:SCXK(黑) 20100027］，体质量(300±20)g。动物室饲养条件，室温18℃ ～22℃，光照周期14 h(06:00～20:00)，湿度为(50±5)%，自由取食、饮水，造模前禁水、禁食，实验过程中尽可能减少动物痛苦。

1.2 实验试剂

DKK1(StemRD，DKK-025B);Rabbit Anti-Wnt3a antibody(Proteintech，ag17232);Rabbit Antiβ-catenin antibody(Proteintech，51067-2-AP); HRP-羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司); DAB显色试剂盒(Vector，USA)。

1.3 KOA模型建立

根据Pomonis JD［5］方法制备KOA大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)进行麻醉，固定备皮，消毒皮肤，曲屈大鼠膝关节，于关节两侧进针，将4%木瓜蛋白酶水溶液0.2 ml注射到膝关节腔内，分别于1、4、7天重复此操作，并在第1次注射2周后进行膝关节Lequesne MG评估级别，总分大于4分表示造模成功，可纳入进行分组干预。

1.4 动物分组及干预方法

将32只大鼠随机分为正常组、模型组、电针组和DKK1组(Wnt抑制剂组)，每组8只大鼠。所有造模组大鼠又按造模成功后5周、7周分为2个亚组，每亚组4只大鼠。正常组也于这两个时间点分为2个亚组，每组4只。所有大鼠分别于造模成功后5周和7周分批处死取材。

正常组:不造模，常规饲养，不给予治疗。

模型组:造模后2周(即造模成功)，行膝关节腔注射生理盐水0.1 ml，每周1次;并且每天给予电针组动物同样方法束缚30 min，每周休息2天。

电针组:造模后2周(即造模成功)，行膝关节腔注射生理盐水0.1 ml，每周1次;并且每天将大鼠固定在特制的鼠架上，将四肢固定，给予电针治疗，取穴太溪穴、曲泉穴(两穴接一组电针，同侧相连，正极在上，负极在下)，内外膝眼对向透刺(两穴接一组电针)，疏密波刺激(Hl为3 Hz，H2为100 Hz，电压为2 v)，以下肢肌肉收缩引起肢体或针柄轻微颤动为宜，留针30 min，每周休息2天。

DKK1组:造模后2周(即造模成功)，行膝关节腔注射0.1 ml浓度为100 μm/L的Wnt阻断剂DKK1，每周1次;并且每天给予电针组动物同样方法束缚30 min，每周休息2天。

1.5 指标检测方法

1.5.1 标本大体评分 标本大体观察:造模成功后5周、7周时间点结束后，给予过量水合氯醛腹腔注射麻醉处死，观察大鼠膝关节软骨，评分标准［6］:0分，关节面光滑;1分，关节面粗糙;2分，关节面糜烂;3分，关节面溃疡;4分，软骨剥脱。

1.5.2 Western Blot测定方法 组织蛋白用RIPA裂解缓冲液提取，蛋白BCA测试盒检测总蛋白的浓度。每个孔装载样本蛋白50 μg。目标蛋白经过电泳转移到PVDF膜。在脱色摇床上，PVDF膜用5%脱脂奶粉的 TBST缓冲液室温封闭 2 h。PVDF膜用一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，然后二抗室温孵育2 h，每个过程之间用 TBST缓冲液清洗3次。Image J软件(NIH，Bethesda，MD，USA)计算条带的灰度值。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较用ANOVA方差分析，多重比较用LSD或者SNK法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠膝关节软骨标本评分比较

模型组大鼠膝关节软骨标本评分明显高于正常组，与同时间点正常组比较，P＜0.05;电针组大鼠软骨标本评分明显低于模型组和DKK1组，与同时间点比较，P＜0.01。见表1。

2.2 各组大鼠膝关节软骨中Wnt蛋白免疫印迹结果

Wnt蛋白在各组不同时间点均较正常组表达增高;与模型组比较电针组、DKK1组(Wnt抑制剂组)均能在5周和7周时间点，降低Wnt蛋白的表达(P＜0.01);而电针组与 DKK1组比较无明显差异(P＞ 0.05)。见表2。

表1 各组大鼠膝关节软骨标本评分比较(例)

表2 各组大鼠膝关节软骨中Wnt蛋白免疫印迹比较(±s)

表2 各组大鼠膝关节软骨中Wnt蛋白免疫印迹比较(±s)

注:与正常组比较，△P＜0.05;与模型组比较，★P＜0.01;与DKK1组比较，☆P＞0.05

组别 例数 造模成功后5周 造模成功后7周正常组8 0.233±0.04 0.193±0.03模型组 8 0.882±0.05△0.793±0.06△电针组 8 0.542±0.08△★☆0.459±0.07△★☆DKK1组 8 0.521±0.06△★0.438±0.07△★

2.3 各组大鼠膝关节软骨中β-catenin蛋白免疫印迹结果

β-catenin蛋白在各组不同时间点均较正常组表达增高;与模型组比较，电针组、DKK1组(Wnt抑制剂组)均能在5周和7周时间点，降低β-catenin蛋白的表达(P＜0.01);而电针组与DKK1组比较无明显差异(P＞0.05)。见表3。

表3 各组大鼠膝关节软骨中β-catenin蛋白免疫印迹比较(±s)

表3 各组大鼠膝关节软骨中β-catenin蛋白免疫印迹比较(±s)

注:与正常组比较，△P＜0.05;与模型组比较，★P＜0.01;与DKK1组比较，☆P＞0.05

组别 例数 造模成功后5周 造模成功后7周正常组8 0.163±0.04 0.143±0.03模型组 8 0.864±0.06△0.773±0.07△电针组 8 0.492±0.08△★☆0.388±0.07△★☆DKK1组 8 0.473±0.06△★0.369±0.07△★

3 讨论

膝关节骨性关节炎是由外因和内因综合导致的关节结构改变或关节软骨破坏，从而使关节功能出现障碍的一种慢性退行性疾病。存在于细胞外基质中蛋白多糖含量下降和Ⅱ型胶原纤维的变形是膝关节骨关节炎发生的重要因素。而Wnt信号通路对关节软骨的形成和分化，在不同时期起不同的双向调节作用，它不仅调控关节软骨的发生和发展，同时也促进软骨细胞的凋亡［7-8］。在相关的实验模型研究中可以发现Wnt信号通路与软骨细胞及骨性关节炎之间存在高度的相关性。Delgado等［9］在患者软骨细胞培养液中发现，骨折患者细胞核中β-连环蛋白要比膝关节骨关节炎患者少，也就是说明同等的炎症刺激下，由于受到更多Wnt蛋白的刺激，上调了膝关节骨关节炎患者β-连环蛋白的表达，进而影响到软骨细胞的调节核代谢。Chan等［10］发现Wnt3a能降低低龄动物成肌细胞增殖能力，促进结缔纤维组织增生呈老化表现。彭旭等［11］在膝骨性关节炎患者中发现Wnt3a和β-catenin蛋白水平明显高于正常对照组，可能提示Wnt信号通路被激活，进而MPCs向软骨细胞的分化能力降低，阻断Wnt信号通路后向软骨细胞的诱导分化能力有所恢复。

本实验研究发现:各组大鼠膝关节软骨，与正常组比较，均有不同程度损伤，在造模成功后5周和7周时间点上看，DKK1组能改善关节软骨的损伤程度，说明抑制Wnt蛋白的表达可以减轻骨性关节炎的受损程度，而电针组与之比较能更好的保护关节软骨，降低关节软骨的损伤。在免疫印迹检测中，发现木瓜蛋白酶诱导的膝关节骨关节炎模型能够激活Wnt信号通路，影响软骨细胞代谢能力，从而降低其修复受损组织的能力。在模型组基础上注射DKK1(Wnt抑制剂)能下调Wnt3a、β-catenin蛋白表达，并能改善关节软骨的损伤程度。值得一提的是，电针干预也能起到类似的保护关节的作用，与注射DKK1相比，亦能明显下调Wnt、β-catenin蛋白的表达，同时也能较大程度的改善受损关节软骨，说明电针在一定程度上可能是通过下调Wnt3a、β-catenin蛋白表达、抑制Wnt信号通路，进而保护受损关节软骨，改善膝骨性关节炎大鼠的关节结构和功能症状。

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Effect of Electroacupuncture on Protein Expressions of Wnt3a and β-catenin in Arthrodial Cartilage of Knee Osteoarthritis Rats

LI Hong-tao1，2，LIU Hao1，YANG Fang-jun3，LI Yan-qiu2，SUN Xiao-wei1，2△
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China)

Objective:To observe the effect of electroacupuncture on Wnt3a，β-catenin protein expression in arthrodial cartilage of knee osteoarthritis rats.Methods:32 healthy male SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，a DKK1 group and an EA group.Induce the rat models of knee osteoarthritis by 4%papain，and use them on the 5th week and 7th week after modeling successfully.Observe the morphological changes of articular cartilage in rats and use Western Blot method to detect the content changes of Wnt3a and β-catenin in articular cartilage rats.Results:The expressions of Wnt3a protein in articular cartilage was low in the normal group on the 5th and 7th weeks，and they were about 0.233±0.04 and 0.193±0.03，respectively; while rats in each model group，the contents of Wnt3a protein in articular cartilage were increased to different degrees at two time points.EA group and DKK1 group were lower than the model group，and it had a statistically significant difference(P＜0.05)，but there was no difference between EA group and DKK1 group(P＞0.05).In the normal group，the expressions of β-catenin protein in articular cartilage was low on the 5th and 7th weeks，and they were about 0.163±0.04 and 0.143±0.03，respectively;while in each model group，the contents of β-catenin protein in articular cartilage were increased to different degrees at two time points.EA group and DKK1 group were lower than the model group，and it had a statistical significance(P＜0.05)，but there was no difference between EA group and DKK1 group(P＞0.05).Conclusion:EA may reduce the expressions of Wnt3a and β-catenin protein，inhibit the Wnt signaling pathway，and then protect the damaged articular cartilage to improve the joint structure and function of knee osteoarthritis rats.

Knee osteoarthritis;Acupuncture;Wnt3a protein;β-catenin protein;Wnt signaling pathway

R245.97

A

1005-0779(2017)03-0065-04

2016-09-07

黑龙江省博士后资助项目，编号:LHB-Z12265.

李洪涛(1979-)，男，副主任医师，硕士研究生导师，在站博士后，研究方向:中西医结合治疗骨与关节疾病研究。

△通讯作者:孙晓伟(1979-)，女，副主任医师，硕士研究生导师，在站博士后，研究方向:针灸治疗神经系统疾病的临床与机理研究。