补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠的影响及机制研究＊

于修芳，董 蕊，曹 玲，王月莹，高海南，耿 放，刘国良，张 宁，4＊＊

（1.黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040；2.哈尔滨师范大学化学化工学院 哈尔滨 150025；3.黑龙江中医药大学佳木斯学院 佳木斯 154007；4.黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室 哈尔滨 150040）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），是一种中枢神经系统退行性病变，是老年期痴呆最常见的一种类型。AD的主要临床表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活[1]。临床上，对于AD的治疗方法有多种，如胆碱酯酶抑制剂，非甾体抗炎药，抗氧化剂等[2,3]，但是目前，尚没有哪种治疗方式可以完全逆转AD患者的进展性病情。因此，针对西药多是单一靶点治疗，且AD发病机制复杂，中药具有多靶点性，研究中药及其复方制剂有望解决上述问题。

中药方剂补阳还五汤由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花七味药组成，具有多种药理作用，包括：改善心肌缺血，抗动脉粥样硬化，抗脑缺血及脑缺血再灌注损伤，对周围神经损伤的修复等[4,5]，临床常用于心脑血管疾病，神经系统疾病的治疗[6,7]。对于补阳还五汤的研究很多，但是从动物多种行为学角度入手的研究却很少，因此，本研究将从行为学角度，研究中药补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠[8,9]学习记忆能力的影响，并探讨其对AD模型小鼠海马炎症因子表达的影响。

本实验通过检测AD模型小鼠海马炎症因子的表达变化，并采用新物体识别实验和避暗实验两种行为学方法，研究补阳还五汤对AD模型小鼠学习记忆能力的影响，为临床治疗AD提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

APP/PS1双转基因小鼠和清洁级C57BL/6J小鼠，雄性，5月龄，体质量40±10 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2015-0001号。饲养环境温度控制在21±1℃的条件下，相对湿度60±10%，保持12 h白天/12 h黑夜的循环，动物自由饮食和进水。

1.2 药物与试剂

补阳还五汤冻干粉剂制备：补阳还五汤由周忠光教授购买于黑龙江中医药大学附属第一医院，并由黑龙江中医药大学实验中心田明教授鉴定，并将生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、地龙、桃仁、红花这七味药制备成水煎剂，冷冻干燥成干粉，置于4℃冰箱中密封保存备用。阳性对照药盐酸多奈哌齐粉末购自于源叶生物（S60449）,补阳还五汤和盐酸多奈哌齐均以生理盐水稀释至所需浓度。兔抗IL-6抗体（批号bs-4587M）、兔抗TNF-α抗体（批号bs-10802R）

兔抗β-actin抗体（批号bs-0061R）、HRP标记羊抗兔IgG（批号bs-0295G-HRP）均购自北京博奥森生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0011）彩色预染蛋白分子量标准（批号P0069）购自碧云天生物技术。

1.3 实验仪器

水迷宫设备（ZH-Morris）购自于安徽正华生物仪器设备有限公司，新物体识别设备（RD1121-NR-M）和避暗设备（RD1106-SB-M）均购自于上海移数信息科技有限公司，一体式微型化学发光成像仪（Smart chemiⅡ）购自北京赛智创业科技公司，mini PROTEAN Tetra Cell（043BR57823）电泳仪，Trans-Blot SD Cell（221BR 53984）半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4 动物分组与处理

APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，每组10只，分别为：模型组，盐酸多奈哌齐阳性对照组，补阳还五汤高、中、低剂量组，10只C57小鼠作为空白组。补阳还五汤高、中、低剂量组每天分别以37.06 g·kg-1，18.53 g·kg-1，9.26 g·kg-1的剂量灌胃，多奈哌齐组小鼠每天以盐酸多奈哌齐0.001 g·kg-1的剂量给予灌胃，模型组和空白组每天灌胃相同体积的生理盐水，灌胃时间持续30天。

1.5 行为学实验

1.5.1 新物体实验

灌胃30天后，进行新物体识别实验，实验分为三个阶段进行：熟悉期、训练期和测试期。第一天为熟悉期，让其自由活动5 min。第二天分为训练期和测试期，训练期将两个形状、大小、颜色和质地完全相同的物体，放到箱体一端，将小鼠背向物体放置在对侧箱壁中点，让其熟悉5 min。1 h后为测试期，用另外一个形状、大小、颜色和质地完全不同的物体替换其中一个。小鼠从相同位置放入，记录小鼠5 min内对新旧物体的探索实践，分别为Tn和Tf。用识别指数 =(Tn-Tf)/(Tn+Tf)表示小鼠对物体的识别能力。

1.5.2 避暗实验

实验装置包括明暗两室，两室间有一个直径为6 cm的圆洞，暗室地图的铜栅接电。训练时将小鼠背对洞口放入明箱，适应3 min后，暗室通40 V、50 Hz交流电，小鼠进入暗室就会被电击。训练期间，弃去避暗潜伏期大于180 s的小鼠。24 h后，进入测试期，记录小鼠5 min内第一次进入暗室的时间（即为潜伏期）和进入次数（即为错误次数）。

1.6 样本采集和海马炎症因子的检测

行为学实验结束后，取材各组小鼠的新鲜海马组织样品，把组织剪成细小的碎片。溶解在含有1%PMSF的RIPA裂解液中，混匀海马组织。冰水中超声震荡30 min。离心和保存。充分裂解后，组织和细胞用离心机14 000 r·min-1离心，4°C下离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中，置于-20℃保存。取各组样品，BCA法测定蛋白浓度。取预染蛋白Maker和40 μg蛋白样品上样，10%SDS-PAGE电泳分离。电泳结束后，用湿法转膜法（80 V，50 min）将目的蛋白转移到PVDF膜上，用脱脂奶粉将膜在室温下封闭2 h，加一抗（1:400）4℃孵育过夜。第二天，用TBST洗4遍，5 min/遍，加入二抗（1:5 000），在室温摇床上孵育2 h，然后，用TBST洗4遍，5 min/遍，ECL成像。

2 数据处理数据

用SPSS18.0统计学软件分析，组间比较利用单因素方差分析（one-way ANOVA），实验数据均用平均数±标准差（±sD）表示，P＜0.05表示有统计学意义。3结果

2.1 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠新物体识别行为学的影响

补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠新物体识别实验的影响结果见表1所示，与空白组相比，模型组小鼠的识别指数明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，补阳还五汤高、中剂量组APP/PS1双转基因AD模型小鼠的识别指数明显提高（P＜0.01）。

表1 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠新物体实验结果

表2 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠避暗实验的影响

图1 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马炎症因子的影响

表3 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马炎症因子的影响

2.2 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠避暗行为学的影响

补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠避暗行为学的影响结果见表2所示，与空白组相比，模型组小鼠逃避潜伏期明显降低（P＜0.01），错误次数明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，补阳还五汤高、中剂量组避暗潜伏期明显增加（P＜0.01），错误次数明显减少（P＜0.01）。

2.3 补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马炎症因子的影响

补阳还五汤对APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马炎症因子的影响结果见图1和表3所示，与空白组相比，模型组小鼠海马炎症因子IL-6和TNF-α表达明显增加（P＜0.01），与模型组相比，补阳还五汤高、中剂量组小鼠海马炎症因子IL-6和TNF-α表达明显降低（P＜0.01）。

3 讨论与结论

本研究采用的两种行为学实验均是阿尔茨海默病代表性的行为学方法。我们预先给予小鼠不同剂量的补阳还五汤，30天后观察它们在新物体识别实验和避暗实验中的行为学变化，以评价补阳还五汤抗阿尔茨海默病的作用。

胆碱能神经元的丢失是AD的一个重要病理学特征，其异常主要体现在：Ach合成减少，胆碱摄取减少，乙酰胆碱转移酶活性降低及胆碱能受体的改变等，胆碱能神经元在维持脑血流，皮质活动，学习记忆及认知功能中发挥着重要作用[10]。临床上，目前对于AD的治疗主要是胆碱酯酶抑制剂，胆碱酯酶抑制剂作用是通过抑制胆碱酯酶的活性，延缓突触间隙中Ach的降低，以增强胆碱能神经元的突触传递功能[11]。且研究表明，APP/PS1双转基因小鼠的早期记忆障碍与胆碱能系统功能异常有关[12]。因此实验中采用乙酰胆碱酯酶抑制剂盐酸多奈哌齐作为阳性药，以此更好的判断补阳还五汤的抗AD作用。

新物体识别实验是通过啮齿类动物先天对新物体具有探索倾向这一习性设计的，实验中通过监测各组动物对新旧物体的探索时间，来进一步评价动物的非空间工作记忆能力[13]。在新物体识别实验中，补阳还五汤高、中剂量组小鼠对新物体探索时间明显长于模型组小鼠，与阳性药盐酸多奈哌齐效果一致，即高、中剂量的补阳还五汤发挥了明显的抗AD作用。

避暗实验原理是利用小鼠的嗜暗习性设计的，实验中动物间的差异较小，是测定小鼠记忆能力的常用方法[14]。在最后的避暗实验中，高、中剂量的补阳还五汤组小鼠的避暗潜伏期较模型组小鼠明显延长，且错误次数明显降低。

研究表明，炎症因子的高表达与AD发生有密切关系，白细胞介素-6（interleukin6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等因子在AD的发病过程中增加了Aβ的沉积[15]。在临床上对AD患者进行抗炎治疗，可改善或延缓患者认知功能的损害进程[16]。实验中通过检测小鼠海马炎症因子发现，补阳还五汤能够明显降低小鼠海马区炎症因子的表达，以此发挥对AD模型小鼠的保护作用。

上述实验结果表明补阳还五汤可以明显降低AD模型小鼠海马区炎症因子的表达，并且能够明显改善其学习记忆能力，与今年来的报道吻合[17,18]。由于补阳还五汤治疗神经系统疾病疗效可靠，服用安全、无明显副作用，进一步探讨其作用机理将具有深远的理论和实际意义。

1 应侠,吴振,雷严,等.阿尔茨海默病的发病机制及治疗药物研究进展.中国药房,2014,25(33):3152-3155.

2 万有才.盐酸美金刚联合其他药物治疗阿尔茨海默病的应用进展.中国药房,2011,22(4):379-380.

3 李梦秋,张文武,陈涛,等.阿尔茨海默病药物治疗临床证据评价.中国现代神经疾病杂志,2014,14(3):192-197.

4 肖洪彬,刘立萍,李然.补阳还五汤现代研究进展与临床应用.中医药信息,2005,22(6):52-54.

5 龙建飞,张秋霞,王蕾,等.补阳还五汤治疗缺血性中风药理作用机制的研究进展.世界中医药,2015,10(05):805-807.

6 罗银河,葛金文,刘林.补阳还五汤治疗缺血性中风的实验研究进展.中华中医药学刊,2015,33(02):269-271.

7 蔡俊,张继平,姚晖,等.补阳还五汤对急性脑缺血再灌注大鼠脑组织AKT和p-AKT蛋白表达的影响.中国实验方剂学杂志,2015,21(06):122-126.

8 骆庆和.快速老化APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型的建立及氧化应激调节AD三转基因小鼠D421位点tau切割的研究.上海:上海交通大学博士学位论文,2014.

9 张茂营.拉莫三嗪改善阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠认知功能的实验研究[D].广州:南方医科大学博士学位论文,2014.

10曾辉,邓冰湘,严杰,等.远志总皂苷对AD模型大鼠学习记忆及海马AchE、ChAT活性的影响.湖南中医药大学学报,2009,29(03):30-32.

11庞睿娟,肖军.胆碱酯酶抑制剂在血管性痴呆中的治疗进展.中华临床医师杂志(电子版),2012,6(10):2727-2729.

12叶芸,张文均,刘柳,等.APP/PS1双转基因小鼠早期记忆功能障碍与胆碱能系统的关系研究.中国神经免疫学和神经病学杂志,2012,19(02):112-115.

13张晓莹,张黎明,李云峰,等.脑室注射脂多糖建立小鼠认知行为障碍模型.解放军医学院学报,2015,36(05):487-491.

14侯悦,吴春福,何祥,等.氟哌啶醇对小鼠在避暗实验中学习记忆获得、巩固和再现过程的影响.中国临床康复,2006,10(34):99-102.

15梁春荣,刘雨辉,王叶冉,等.阿尔茨海默病患者外周血炎症因子水平与认知功能的相关性研究.解放军医学杂志,2014,39(02):133-137.

16毕丹蕾,文朗,熊伟,等.阿尔茨海默病的可能药物靶点和临床治疗研究进展.中国药理学与毒理学杂志,2015,29(04):507-536.

17费洪新,周忠光,姜波,等.补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠学习记忆及海马β淀粉样前体蛋白的影响.中国实验方剂学杂志,2014,20(20):125-128.

18费洪新,周忠光,刘旭,等.补阳还五汤对阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元细胞凋亡的影响.中国医学装备,2014,11(S2):427-429.