甘草断面颜色与其有效成分的相关性分析＊

米文娟，林相龙，李 阳，陈慧荣，闫永红＊＊，邹慧琴＊＊

（1.北京中医药大学中药学院 北京 102488；2.北京宝德润生医药科技发展有限公司 北京 100088）

历代本草对甘草的性状鉴别以“皮细紧，色红棕，质坚实，断面颜色黄色，粉性足、横纹等”为佳[1]。从颜色角度讲，甘草“断面颜色黄色”为甘草质优的性状评价指标之一，但是颜色究竟黄到什么程度才算佳品？药材个体差异和鉴别人员对色泽细微差别的不敏感性等，都会导致感官评价的不确定性和模糊性，因此，本研究以甘草为模型药物，运用色度计将甘草断面颜色进行量化。而药材的颜色往往与内在成分的含量有着密切联系，甘草主要化学成分黄酮、三萜皂苷和多糖类化合物具有清热解毒、免疫调节、抗炎等作用[2-5]，故采用高效液相色谱法（HPLC）、紫外分光光度法（UV）等对甘草中的甘草苷、甘草酸、总黄酮、总皂苷和多糖相应进行含量测定，研究甘草断面颜色与有效成分之间的变化规律，以探讨颜色数字化测定的可行性和颜色特性与中药质量评价的相关性，揭示传统中药材性状鉴别的科学性。色度现已广泛应用于中药领域的颜色测定[6-12]，常用评价系统为CIE1976 L*a*b*标准色度系统，其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色调方向。

L*：值越大明度越大，感觉越白；反之越暗。a*：表示红绿方向，+a*表示红方向，-a*表示绿方向。b*：表示黄蓝方向，+b*表示黄方向，-b*表示蓝方向。ΔE*ab={(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2}1/2:ΔE*ab为色差，通常认为其小于或等于1时，人眼将无法分辨两种颜色的差异。

1 材料

收集来自甘肃西部地区、内蒙古杭锦旗地区、内蒙古通辽、赤峰地区野生及栽培甘草样品共34批，经北京中医药大学中药鉴定系闫永红教授鉴定为豆科植物甘草G.uralensis Fisch.的干燥根及根茎。甘草酸铵标准品（中国食品药品检定研究院，生产批号110731-200615，供含量测定用，含量按93.1%计，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207），甘草苷标准品（中国食品药品检定研究院，生产批号111610-201005，含量＞98.0%，供含量测定用），D-葡萄糖（北京拜尔迪生物公司，分析纯，含量＞=99.5%），氢氧化钾（上海化学试剂采购供应站，批号63-07-28，含量＞=82.0%），香草醛（天津市福晨化学试剂厂，批号20110907，含量＞=99.0%），乙腈（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，色谱纯），甲醇、乙醇、磷酸、硫酸、冰醋酸（北京化工厂，分析纯），苯酚（北京博奥拓达科技有限公司，分析纯），水为屈臣氏纯净水。

表1 梯度洗脱中流动相的比例

图1 甘草药材中甘草酸、甘草苷HPLC色谱图

Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Ag⁃ilent 1100色谱工作站；0.45 μm针筒式微孔滤膜过滤器；DIKMA Platisil ODS色谱柱（5 μm，250×4.6 mm）；BP211D型万分之一电子分析天平(德国赛多利斯)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)。日立U-3010型紫外-可见分光光度计；DZKW-C电子恒温水浴（北京光明医疗仪器厂）。

2 方法

2.1 断面颜色测定方法[12]

2.1.1 样品制备

将甘草切成长约2 cm的小段，对甘草段施以压力令表皮脱落，将去皮的甘草段打粉，过3号筛，粉末置于自制玻璃测色皿中，盖上石英镜片，以测色皿中粉末不随意晃动为准。

2.1.2 颜色测定条件

采用日立3010紫外可见分光光度计进行测量，测量起止波长：380-780 nm；狭缝宽度：1 nm；照明光源：D65；视场选择：10度视角；扫描速度：600 nm·min-1。

2.1.3 色度计测定稳定性考察

随机取杭锦旗野生样品5份，按上述方法制备测量，结果显示RSD均小于3%，结果间ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可变辨范围。表明结果稳定。

2.2 HPLC测定甘草苷、甘草酸[13]

2.2.1 甘草酸及甘草苷含量测定方法

采用2015《药典》甘草含量测定项下规定的甘草酸及甘草苷的含量测定方法，进行高效液相色谱测定。

2.2.2 色谱条件

流动相A为乙腈，B为0.05%磷酸水；梯度洗脱，比例见表1；检测波长为237 nm，进样量10 uL，分离结果见图1。

2.2.3 供试品溶液制备

精密称定甘草粉末（过三号筛）0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，称重，超声（功率250 W，频率49 kHz）30 min，放冷后再次称定重量并补足失重，摇匀滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.4 标准品溶液制备

精密称定甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇并稀释至刻度，即得标准品储备液。该储备液每1 mL含甘草苷0.0242 mg、甘草酸铵0.2012 mg（折合甘草酸为0.1971 mg）。

2.2.5 标准曲线及线性关系考察

精密吸取标准品储备液 2、5、7、10、12、15、17、20 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品的量（μg）为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，甘草酸为：Y=491.1X+4.238（R²=0.999），线性范围0.3942-3.942 μg；甘草苷为：Y=2 320X+83.34（R²=0.997），线性范围0.048 4-0.484 μg。

2.2.6 精密度考察

将采集的甘草样品进行编号，精密称取16号甘草样品0.2 g，按2.2.3方法制备测量，连续进样5次。甘草苷、甘草酸峰面积RSD分别为0.585%、0.687%，表明该法精密度良好。

2.2.7 重复性考察

精密称取16号甘草样品0.2 g，共5份。按2.2.3方法制备测定。甘草苷、甘草酸峰面积RSD分别为1.148%、1.692%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性考察

精密称取16号甘草样品0.2 g，按2.2.3方法制备测定，分别于0、4、8、12、24、48 h测定峰面积。甘草苷、甘草酸峰面积RSD分别为0.705%、1.164%，表明供试液在48 h内基本稳定。

2.2.9 加样回收率考察

取已知含量的16号甘草样品0.15 g，共5份，精密称定。分别置具塞锥形瓶中，各加入甘草苷、甘草酸单铵盐混合溶液2 mL（甘草酸浓度为1.704 1 mg⋅mL-1；甘草苷浓度为0.630 4 mg⋅mL-1），按2.2.3方法制备，并进行色谱条件测定。甘草酸，计算得率为99.25%，RSD为1.467%，符合要求；甘草苷，计算得率为99.81%，RSD为1.757%，符合要求。

2.3 比色法测定总皂苷

2.3.1 标准品溶液配制

精密称定甘草酸铵标准品适量，甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，制得0.1016 mg⋅mL-1的对照品溶液，折合甘草酸为0.0995 mg⋅mL-1（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）

2.3.2 供试液的制备及测定

取干燥的甘草粉末约0.5 g，精密称定，加70%乙醇50 mL，水浴回流2 h，回流液过滤，取滤液，并用70%醇反复冲洗滤渣至洗涤液无色透明，合并滤液减压回旋至干，用0.5%氨水10 mL溶解过滤，精密移取滤液2 mL至10 mL离心管，用3.5 mol⋅L-1硫酸调节PH值至2-3，低温离心，去除上清液，将沉淀用稀氨水溶解，如此“酸沉碱溶”操作重复4次后，将稀氨水溶解液定容至100 mL，即为供试液。供试液取0.5 mL于具塞比色管中，加80%乙醇0.5 mL、4.5%香草醛0.5 mL，冰水浴，再加78%硫酸5 mL，涡旋混匀，水浴加热20 min，冷却至室温，在533 nm处测量吸光度。

2.3.3 线性关系的考察

精确吸取上述甘草酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，显色后在533 nm处测量吸光度。以吸光度A为纵坐标，对照品的质量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.010X－0.012（R²=0.999），线性范围9.95-49.75 μg。

2.3.4 方法学考察

分别进行精密度、重现性、稳定性和加样回收率考察，经计算RSD值分别为0.784%、1.241%、0.752%、1.324%，平均回收率为98.384%。均符合条件。

2.4 紫外分光光度法测定总黄酮

2.4.1 标准品溶液配制

取甘草苷标准品适量，精密称定，用80%乙醇溶解定容至20 mL容量瓶中，得0.9832 mg⋅mL-1的对照品储备液。

2.4.2 供试品溶液制备及测定

精密称取甘草粉末250 mg，加25 mL 80%乙醇，称重，超声提取40 min，称重，补足失重，过滤，取续滤液，即为供试液。精密吸取上述供试液0.5 mL，加入0.5 mL 80%乙醇、0.5 mL 10%KOH溶液，摇匀，室温静置5 min，用80%乙醇定容至10 mL。另取上述样品溶液0.5 mL，直接用80%乙醇定容至10 mL，作为空白对照，于400 nm处测定吸光度。

2.4.3 线性关系考察

精确吸取上述甘草苷对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别加入80%乙醇1 mL、10%KOH溶液0.5 mL，混匀，室温静置5 min，用80%乙醇定容至10 mL，于400 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，甘草苷的量(μg⋅mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=0.021X－0.095(R²=0.998)，线性范围为9.83-49.16 μg⋅mL-1。

2.4.4 方法学考察

分别进行精密度、重现性、稳定性和加样回收率考察，经计算RSD值分别为0.551%、0.734%、0.853%、1.655%，平均回收率为99.496%。均符合条件。

2.5 硫酸-苯酚比色法测定多糖

2.5.1 标准品溶液配制

葡萄糖对照品适量，105℃干燥至恒重，精密称量25.4 mg，置于250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，混匀，得浓度为0.1016 mg⋅mL-1的葡萄糖标准溶液，备用。

2.5.2 甘草多糖提取与精制

称取甘草粉末120 g，600 mL石油醚（60-90℃）回流提取2次，每次1 h，残渣挥干溶剂，用600 mL 80%乙醇回流提取2次，每次2 h，残渣挥干溶剂，再用700 mL水回流提取3次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩至300 mL，浓缩液用sevag法除蛋白，即氯仿：正丁醇（4∶1）多次萃取，萃取液加入95%乙醇约5倍量，使含醇量达80%，静置。抽滤析出多糖，沉淀先后用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，60℃真空干燥，得甘草多糖纯品。

表2 甘草样品断面颜色测量指标值

2.5.3 换算因子的测定

将2.5.2法精制得到的甘草多糖干燥至恒重，精密称定10 mg，共3份，分别置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀备用。取此备用液1 mL依次加入1 mL蒸馏水、1 mL 50 g·L-1苯酚溶液，5 mL浓硫酸，混匀后水浴15 min，室温冷却25 min，测定吸收值，从回归方程中求出供试液中葡萄糖浓度（C），按下式计算换算因子f=W/CD，W为多糖重量（μg），C为多糖液中葡萄糖浓度（μg⋅mL-1），D为多糖溶液稀释因素，得f=2.120。

2.5.4 供试品溶液的制备及测定

精密称取干燥至恒重的甘草样品粉末约0.1 g，置于圆底烧瓶中，加入80 mL 80%乙醇，浸泡过夜，超声30 min，过滤后药渣继续超声30 min，过滤，药渣挥干溶剂，用蒸馏水100 mL回流提取2 h，将回流液转移至250 mL容量瓶，定容至刻度。取供试液1 mL依次加入1 mL蒸馏水、1 mL 50 g⋅L-1苯酚溶液，5 mL浓硫酸，混匀后水浴15 min，室温冷却25 min，在490 nm处测定吸光度。

2.5.5 线性关系的考察

精确量取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于试管中，分别用蒸馏水补足至1 mL，加入1 mL苯酚溶液，摇匀，再加5 mL浓硫酸，使其充分混匀，室温放置25 min。另取葡萄糖溶液1 mL于试管中，作为空白对照。于490 nm处测定吸收值，以吸收值（A）为横坐标，葡萄糖浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.083X－0.033（R²=0.998）。线性范围1.27-10.16 μg⋅mL-1。

2.5.6 方法学考察

分别进行精密度、重现性、稳定性和加样回收率考察，经计算RSD值分别为0.426%、0.454%、1.350%、0.67%，平均回收率为99.1%。均符合条件。

3 结果

3.1 甘草样品颜色值的测量结果

按照2.1项方法，对34批甘草样品分别进行颜色值的测量，每个样品重复测定三遍，记录颜色指标的平均值，结果见表2。

3.2 甘草五种有效成分含量的测定结果

对甘草的甘草酸、甘草苷、总皂苷、多糖、总黄酮含量测定结果见下表3：

3.3 甘草有效成分含量与颜色指标值相关性结果

将甘草有效成分含量分别与颜色指标值L*、a*、b*相关联，使用SPSS软件做相关分析，相关结果见下表4、5、6、7、8：

表3 甘草五种有效成分含量

4 讨论

结合表2、表3，发现甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷含量符合以下规律：质量较优＞质量一般＞质量较差样品。多糖含量规律不明显。单从断面颜色来看，断面颜色为黄色的样品甘草酸等四种有效成分含量高于黄色偏白的样品，这同传统性状鉴别中甘草断面颜色越黄质量越好的结论相符合。以上结论一定程度证明了传统性状颜色分类的可行性。

表4 甘草酸与L*、a*、b*相关系数表

表5 甘草苷与L*、a*、b*值相关系数表

表6 总黄酮与L*、a*、b*值相关系数表

表7 多糖与L*、a*、b*值相关系数表

表8 总皂苷与L*、a*、b*值相关系数表

含量测量值同颜色测量值相关性分析结果显示，甘草断面颜色L*值同甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷在指定水平内均呈显著负相关，即L*值越大，甘草断面颜色越淡，甘草酸等四种有效成分含量就越低；b*值同五种有效成分都存在显著相关，同甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷均呈正相关，在一定程度上表示b*值越大，甘草颜色越黄，则甘草中的甘草酸等四种有效成分含量就越高，同多糖含量呈负相关，在一定程度上b*值增大，多糖含量下降。a*值表示红绿方向，对甘草而言，a*值不作讨论。

综上结果，首先，本研究初步揭示甘草断面颜色与有效成分之间的变化规律，通过颜色的数字化测定可以快速客观地初步判断或预测甘草的中化学成分的含量。第一，甘草中的甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷与色度计中颜色明度值L*呈显著负相关，即L*越高，甘草酸等四种有效成分越高；第二，甘草中的甘草酸、甘草苷、总黄酮、总皂苷与色度计中b*值呈显著正相关，即b*越高，甘草酸等四种有效成分越高；多糖与b*呈显著负相关，即b*越高，多糖含量越低。其次，目前“辨状论质”仍是中药质量评价中不可或缺的评价方法之一，但这种评价方法缺乏一套科学客观且符合中医药理论思想的药材质量评价标准。本实验在继承中医药传统理论思想的指导下，引入色度计对颜色进行量化，证明使用色度计评价甘草质量的可行性、有效性。最后，建议在今后的研究中，尽可能继续扩大样本量进行实验，使获得的实验数据更具有代表性和广泛性，同时保证此方法的准确性；并进一步推广此方法，建立一种快速有效、客观可控的中药质量评价新方法。

1 解军波.不同道地性状甘草的化学成分比较研究.中华中医药学会中药鉴定分会.中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集——祝贺中华中医药学会中药鉴定分会成立二十周年.中华中医药学会中药鉴定分会,2008:4.

2 何丹,刘凤琴,李焕德.甘草解毒作用研究进展.中南药学,2009,7(12):927-931.

3 张明发,沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎与抗炎机制的研究进展.现代药物与临床,2011,26(4):261-268.

4 刘丽萍,任翠爱,赵宏艳.甘草酸的免疫调节作用研究进展.中国实验方剂学杂志,2010,16(06):272-276.

5 李晓红,齐云,蔡润兰,等.甘草总皂苷抗炎作用机制研究.中国实验方剂学杂志,2010,16(05):110-113.

6 吴建华,刘婧,吴志瑰,等.颜色量化及其在中药中的应用研究进展.江西中医药大学学报,2016,28(05):114-115+119.

7 谢晋,彭华胜,张群林,等.基于颜色特征的牡丹皮贮藏年限鉴别及质量评价研究.中药材,2016,39(06):1232-1235.

8 王浩,陈力潇,黄璐琦,等.基于德尔菲法对中药白术商品规格等级划分的研究.中国中药杂志,2016,41(05):802-805.

9 王浩.中药白术商品规格等级及其行业标准研究.石家庄:河北医科大学硕士学位论文,2016.

10李雪莲.白术麸炒过程中颜色与物质基础变化相关性研究.成都:成都中医药大学硕士学位论文,2015.

11.杨丽.枸杞子颜色变化与物质基础相关性研究[D].成都:成都中医药大学硕士学位论文,2015.

12邹慧琴,李硕,林相龙,等.基于色度学理论的甘草颜色数字化方法学研究.世界科学技术-中医药现代化,2014,16(12):2681-2685.

13国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:87.