SD大鼠腹腔脂肪干细胞分离培养和鉴定

张洋洋，陈良安

(1.承德医学院附属医院呼吸内科，河北 承德 067000；2.中国人民解放军总医院呼吸内科，北京 100853)

·论 著·

SD大鼠腹腔脂肪干细胞分离培养和鉴定

张洋洋1，陈良安2

(1.承德医学院附属医院呼吸内科，河北 承德 067000；2.中国人民解放军总医院呼吸内科，北京 100853)

目的建立一种有效的分离、培养SD大鼠腹腔脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ASCs)的方法，从而为大鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的来源提供更广阔的选择。方法取4周龄雄性SD大鼠的腹腔脂肪组织，经0.1%Ⅰ型胶原酶消化，离心、洗涤后间充质干细胞专用培养基重悬，置于细胞孵箱中培养，长至80%融合后用0.25%胰酶-EDTA消化、传代培养，绘制细胞生长曲线，进行细胞形态、表面标志、成骨及成脂分化潜能鉴定。结果ASCs贴壁生长，原代ASCs呈短小梭形，经传代后和培养时间的延长，细胞变为长梭形，旋涡状排列。培养第2、4、5、6 d时，第5代的ASCs A值低于第3代，第8代的ASCs A值低于第3代和第5代，差异均有统计学意义(P<0.05)。ASCs阳性表达CD29、CD54、CD90.1，不表达CD31、CD45、CD106。结论通过贴壁培养可以从SD大鼠腹腔脂肪组织分离培养出高纯度的ASCs，此种方法获得的ASCs增殖速度快，可以成为SD大鼠MSC的来源。

间质干细胞；细胞培养；生长曲线；脂肪组织；大鼠

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞,这类细胞具有高度的自我更新能力，能够向外胚层、中胚层和内胚层三系分化，广泛存在于全身结缔组织和各个器官间质中。MSCs具有免疫调节、抗炎和分泌促进组织修复的各种因子等作用，因此在再生医学和临床应用方面有着巨大的潜能[1-4]。脂肪源性的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)为MSCs的一种，因脂肪来源丰富，并且易于获得以及纯化，目前已成为成体干细胞研究的理想来源之一。SD大鼠是较为广泛的基础实验的动物模型之一。目前大鼠ASCs的分离主要应用腹股沟脂肪组织，本研究拟建立简单、高效的SD大鼠腹腔ASCs分离培养方法，并对所获得的细胞进行鉴定，旨在为后续实验做铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 4周龄健康雄性SD大鼠4只，体质量60～80 g，无特定病原体实验动物(specific pathogen free,SPF)级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。MSCs专用培养基(美国Sciencell公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；细胞表面荧光标记抗体(德国Miltenyi Biotec公司)；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基(塞业广州生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 实验方法 SD大鼠ASCs的分离培养：将4周龄雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，浸于75%乙醇中消毒皮肤10 min。将SD大鼠以仰卧位置于超净操作台上，用手术剪无菌条件下逐层剪开腹部皮肤、肌肉，暴露腹腔，剪取肾脏周围、附睾周围及腹后外侧脂肪组织，置于玻璃皿中，用无菌预冷的PBS反复冲洗3次，去除肉眼可见的血管和纤维成分。将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎块，移入锥形瓶中，加入10倍脂肪体积的0.1% Ⅰ型胶原酶，于37 ℃恒温水浴中振荡消化30 min，将消化后的悬液移入离心管，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用PBS洗涤1遍，再次离心后弃上清，用间充质干细胞专用培养基重悬沉淀，计数并调整细胞浓度至1×105/cm2，之后将细胞悬液接种于60 mm培养皿，置于37 ℃体积分数5% CO2孵箱中培养，48 h后首次换液，以后每3 d进行1次换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，约80%融合时，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，约1 min细胞回缩变圆，加入间充质干细胞专用培养基中和胰蛋白酶，移液枪吹打混匀后以1∶3传代培养，传代后次日换液，以后每3 d换液1次。用倒置相差显微镜逐日观察原代及传代ACSs形态，并拍照记录。

ASCs增殖能力检测：取第3代、第5代及第8代ASCs，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，间充质干细胞专用培养基中和胰蛋白酶，移液枪吹打混匀后计数，以1×103个/200 μL/孔接种于96孔板，含4个复孔，置于37 ℃体积分数5% CO2孵箱中培养，每天取出1块96孔板，共7 d，每孔中加入20 μL MTT，置于细胞孵箱中孵育4～6 h后吸除培养液，每孔加入150 μL DMSO，摇床振荡10 min，490 nm酶标仪测定吸光度(A值)，绘制细胞生长曲线。

ASCs表面抗原鉴定：取融合达80%的第5代ASCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，间充质干细胞专用培养基中和胰蛋白酶，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，巴氏吸管反复吹打制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为1×106个/1.5 mL，然后分装入EP管，每份检测样本细胞数不低于1×106个，1 000 r/min离心10 min后45 μL PBS重悬，分别加入CD29-FITC、CD31-PE、CD45-FITC、CD54-PE、CD90.1-FITC、CD106-PE，各5 μL，设阴性对照，4℃避光孵育10 min，PBS洗涤2遍以去除未结合的抗体，使用流式细胞仪进行检测。

ASCs成骨诱导及鉴定：取第3代ASCs，消化后接种于6孔板，待细胞长至80%融合，换用成骨诱导培养基，每2 d换液1次。诱导7 d后行茜素红染色，在倒置显微镜下进行观察和拍照。

ASCs成脂诱导及鉴定：取第3代ASCs，消化后接种于6孔板，待细胞长至80%融合，组换用成脂诱导培养基，每2 d换液1次。诱导7 d后行油红O染色，在倒置显微镜下进行观察和拍照。

1.3 主要观察指标细胞形态学，细胞生长情况，流式细胞表面标志物鉴定及成骨细胞、成脂细胞诱导分化。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ASCs形态学观察 倒置显微镜下直接观察，原代细胞2 d首次换液，可见少量短小梭形细胞贴壁。随着培养时间延长，可观察到细胞集落逐渐增大，7～10 d可传代，传代后细胞呈长梭形，旋涡状排列。见图1，2。

2.2 ASCs增殖活性测定 从生长曲线可见ASCs细胞在培养1、2 d为潜伏期，2～4 d为对数生长期，4～7 d为衰退期。细胞活性测定：培养1、3 d时，第3代、第5代、第8代ASCs吸光度差异无统计学意义(P>0.05)；培养2、4、5、6 d时，第5代的ASCs吸光度低于第3代，第8代的ASCs吸光度低于第3代和第5代，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表1。

表1 第3代、第5代、第8代ASCs不同培养时间吸光度值变化

*P<0.05与第3代比较 #P<0.05与第5代比较(q检验)

2.3 ASCs表面标志检测 经流式细胞仪检测，CD29、CD31、CD45、CD54、CD90.1、CD106的表达率分别为99.93%、0.46%、0.32%、99.84%、96.31%、2.76%，即ASCs阳性表达CD29、CD54、CD90.1，不表达CD31、CD45、CD106。

2.4 ASCs成骨诱导及鉴定 加入成骨诱导培养基后细胞逐渐停止扩增，出现矿化物，第7天进行茜素红染色为阳性，见图4。

2.5 ASCs的成脂诱导及鉴定 加入成脂诱导培养基后，细胞逐渐回缩变为圆形、椭圆形，第3天部分细胞可见较小脂滴，第7天时脂滴明显变大、增多，油红O染色阳性，见图5。

3 讨 论

Friedenstein等[5]在1968年首次于骨髓中分离出了MSCs，早期的相关研究主要集中应用骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs分离步骤复杂、耗时长，且目前普遍应用的贴壁培养法较难得到高纯度的BMSCs。应用流式细胞仪进行分选，BMSCs会被高能激光以及机械剪切力损伤，导致分离的细胞活性较低。免疫磁珠分选法可获得较高纯度的BMSCs，但操作过程复杂，而且费用很昂贵。骨髓中MSCs含量很少，每毫升的骨髓中仅能获得100～1 000 CFU-F，随着年龄增长数量进一步减少，如果应用于临床可能需反复穿刺，给患者带来痛苦，因此BMSCs的临床应用受到限制。

2001年Zuk等[6]首次从人吸脂术的脂肪中分离培养出了ASCs，此后ASCs的分离和纯化技术不断改进，300 mL脂肪抽吸术获得的脂肪可以分离出1×107个ASCs，而且纯度高达95%[7]。脂肪组织来源充分，局部麻醉后即可抽吸脂肪，获取方便，而且ASCs的分离过程简单[8]，增殖速度快，临床应用不存在伦理学争议，已成为当今干细胞研究领域的热点种子细胞之一。ASCs与BMSCs在体外三系分化潜能和基因表达谱方面均没有明显差异[9]。ACSs虽具有多向分化潜能，但截至目前尚无研究发现其有致瘤风险，因此具有较好的安全性。ASCs不表达Ⅱ类主要组织相容性复合体[10]，具有低免疫原性、低免疫调节功能，移植排斥反应发生率低[11]，除了适用于自体移植外，还可以用于同种异体移植，因此在移植治疗上具有显著优势。ASCs治疗疾病的相关研究大量涌现，如治疗心肌梗死、脑梗死、糖尿病、急性肺损伤、骨折、烧伤、脊髓损伤、肝硬化、急性和慢性肾损伤、系统性硬化症、乳腺癌术后乳腺重建等[12-19]。ASCs的具有良好的临床应用前景，目前仅于美国国立图书馆临床试验注册中心注册的ASCs治疗相关的临床试验就已多达30余项。近些年，一系列动物实验证实MSCs外分泌体在脑卒中、心肌缺血再灌注损伤、药物性肝损伤等动物模型中有类似于MSCs的治疗作用[20-22]，提取外分泌体需要大量的MSCs，而ASCs来源充分及获取方便，成为外分泌体研究的可靠细胞来源。但ASCs作为一种生物治疗手段，在大规模应用到投入到临床使用前，仍需对其有效性、安全性、详细的治疗机制等进行深入研究，对一些目前尚缺乏有效治疗措施的少见病、罕见病也可以考虑是否能将MSCs作为一种治疗手段，而这些研究仍依赖于大量的动物基础实验。

SD大鼠是基础研究最为常用的实验动物之一，目前大鼠ASCs的分离主要应用腹股沟脂肪组织，但该部位的脂肪组织富含血管和淋巴结，分离过程中不易去除，腹腔脂肪组织的细胞种类则相对单一。大鼠的年龄是决定ASCs分离成败的关键因素之一。本研究选取4周龄雄性SD大鼠，分离腹腔脂肪组织，获得的ASCs形态较为一致，传代至第8代仍有较好的形态和较快的增殖速度；但相比而言，第3代较第5代和第8代的活性更高。

脂肪组织中包括前脂肪细胞、成熟脂肪细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞等多种细胞。ASCs是脂肪组织中具有多向分化潜能的细胞，通过胶原酶消化脂肪组织可获得，目前尚缺乏特异性的细胞表面标记物。ASCs的鉴定需结合细胞形态、贴壁性、细胞表面标志及多向分化潜能等进行综合判断，ASCs区别于BMSCs的特点之一是CD106表达阴性[23]。本研究采用37 ℃恒温水浴条件下应用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，从脂肪组织中分离的梭形、贴壁细胞进行传代培养，传至第3代进行成脂和成骨诱导分化，经油红O、茜素红染色鉴定诱导成功，传至第5代进行细胞表面抗原流式鉴定，CD29、CD54、CD90.1为阳性，CD31、CD45、CD106为阴性。与文献报道相符[24]。

综上所述，本研究选取4周龄雄性SD大鼠，分离腹腔脂肪组织，经0.1% Ⅰ型胶原酶于37 ℃进行消化，30 min后离心、洗涤，MSCs专用培养基重悬后接种于培养皿，置于37 ℃体积分数5% CO2孵箱中培养，48 h后首次换液，经传代培养，可获得高纯度、高增殖速率的ASCs，可作为SD大鼠MSCs应用于实验研究。(本文图见封三)

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(本文编辑：刘斯静)

Isolation, culture and identification of adipose tissue-derived stem cells from Sprague Dawley rat's abdominal cavity

ZHANG Yang-yang1, CHEN Liang-an2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HeibeiProvince,Chengde067000,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China)

Objective To establish an effective and simple method for isolation and expansion of the adipose tissue-derived stem cells(ASCs), by using the adipose tissues of abdominal cavity of Sprague Dawley rat, and to provide another choice for cell source of mesenchymal stem cells(MSCs). Methods The adipose tissues were obtained from the abdominal cavity of Sprague Dawley rats aged 4 weeks. 0.1% collagenase Ⅰ was chosen for digesting the adipose tissues. After washing and centrifugation, the cells were re-suspended in mesenchymal stem cell medium and cultured in cell incubator. The growth rate was assessed by MTT assay. ASCs were then verified by the flow cytometry analysis and differentiation assays. Results ASCs were spindle-like in shape and adhered to the plastic tissue culture medium, with high multiplication rate. The absorbance value of passage 5 was lower passage 3, and the absorbance value of passage 8 was lower than passage 3 and passage 5 on day 2, 4, 5 and 6(P<0.05). ASCs were positive for CD29, CD54 and CD90.1, but negative for CD31, CD45 and CD106. Conclusion ASCs can be effectively isolated and expanded from the adipose tissues of abdominal cavity of Sprague Dawley rat, by using adherent culture. And ASCs from adipose tissues of abdominal cavity may be a good multipotential cell candidate for future cell replacement therapy.

mesenchymal stem cells; cell culture technique; growth charts; adipose tissue; rats

2016-01-21；

2016-02-17

张洋洋(1983-)，女，河北承德人，承德医学院附属

R332

A

1007-3205(2017)03-0258-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.003

医院主治医师，医学硕士，从事呼吸内科疾病诊治研究。