重金属离子Cu2+和Zn2+胁迫对早熟禾润草1号生理特性的影响

赵忠涛+张丽+李超

摘要：采用盆栽方法研究了不同浓度Cu2+、Zn2+胁迫对早熟禾（Poa pratensis L.）品种润草1号（P. pratensis cv. Runcao No.1）生理特性的影响。通过检测润草1号叶片的叶绿素、脯氨酸含量和细胞膜透性，以及根系活力的变化，发现低浓度的Cu2+、Zn2+刺激了润草1号的生长，提高了叶片的叶绿素含量以及根系活力；但高浓度的Cu2+、Zn2+能够导致润草1号叶片的叶绿素含量、根系活力不同程度地下降。

关键词：早熟禾（Poa pratensis L.）；重金属；胁迫；生理特性

中图分类号：S688.4+78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）02-0295-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.023

在自然界里，重金屬元素很难被生物体降解，并且重金属元素还可以在食物链的传递下，在生物体内层层富集，造成严重的生态危害。土壤中重金属元素的污染可能会导致土壤肥力的降低与流失、作物产量降低和品质劣化、水环境污染加重等严重后果。因此，如何修复土壤的重金属元素污染，是环境和生态保护所亟待破解的重大课题之一。而在重金属元素污染较重的区域种植耐受性较高的植物，特别是非食用性的耐受性较高的植物，是非常有效的恢复生态环境的途径之一[1，2]。铜（Cu2+）和锌（Zn2+）是植物生长所必需的元素之一。在正常的生理状态下，植物体对于Cu2+和Zn2+的吸收主要是通过主动吸收过程来实现。但植物对于Cu2+和Zn2+的主动吸收过程是受到代谢调控的。当Cu2+和Zn2+的浓度超过一定限度时，会对植物体产生不良影响。轻的会使植物体正常的代谢功能发生紊乱，妨碍植物体的正常生长发育；严重情况下甚至导致植物体的死亡。某些植物在长期的自然选择或人工筛选下，获得了某些特异的代谢功能，使得植物能够在重金属含量较高的环境中正常生长，这就是植物的重金属耐受性[3]。早熟禾（Poa pratensis L.）主要适宜于南方地区露地栽培，是草坪绿化常用的地被植物之一。其主要用于观赏草坪的建植，对于降低环境污染、完善城市绿化及美化起着非常重要的作用[4]。润草1号（P. pratensis cv. Runcao No.1）是一个新选育的早熟禾品种，于2012年由江苏农林职业技术学院培育而成。润草1号属于低矮型草坪草，坪用性状优良，具有较强的耐荫、耐热性能，抗倒伏和抗病能力强。试验以润草1号为材料，研究了其在不同浓度的重金属元素Cu2+和Zn2+胁迫下生理生化指标的变化规律，以期为今后开发利用润草1号用于Cu2+和Zn2+污染的土壤修复提供理论依据，并为润草1号在城市园林的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试草地早熟禾品种润草1号由江苏农林职业技术学院提供，供试土壤取自学院花房土质较好的表层土壤，Cu2+添加形式为CuSO4，Zn2+添加形式为ZnCl2，均为分析纯。

1.2 处理设置

室外盆栽试验于2014年9月至2014年11月在江苏农林职业技术学院实施。供试土壤风干后过0.5 cm筛，按照1∶3将草炭土和土壤混合配制，并称重5.0 kg装入花盆中，然后定植润草1号。15 d后，分别浇灌Cu2+和Zn2+溶液。以不使用Zn2+、Cu2+处理作为对照，Zn2+、Cu2+浓度梯度均设置为5、10、20、50、100 mg/kg，每个处理重复3次。

1.3 测定方法

1.3.1 叶绿素含量的测定 称取新鲜叶片0.2 g于研钵中，加入少量碳酸钙粉和石英砂，再加入2～3 mL的95%乙醇，研磨成匀浆。滤纸过滤到25 mL棕色容量瓶中，并用少量乙醇处理研钵、研棒、残渣和滤纸上的叶绿体色素，直至滤纸和残渣中无绿色为止。乙醇定容，摇匀。将提取液倒入比色杯内，以95%乙醇为空白，分别在665、649、470 nm处测定吸光度。平行重复3组[5]。

1.3.2 脯氨酸含量的测定 取剪碎混匀的新鲜叶片0.2 g置于大试管中，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液；管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提15 min。待冷却至室温后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL茚三酮显色液，于沸水浴中加热15 min。冷却后加入5 mL甲苯，摇匀萃取，避光静置待完全分层。用移液枪吸取甲苯层液体于石英比色皿中，于520 nm处测定吸光度，再根据标准曲线求出脯氨酸含量。平行重复3组[5]。

1.3.3 细胞膜透性的测定 选取新鲜叶片若干，吸干水分后剪下，拭净，用电子天平称取2份，各重2 g。1份放入40 ℃恒温箱内萎蔫1 h，另1份放在烧杯中在室温下做对照。处理后分别用去离子水冲洗，准确加人20 mL去离子水浸没叶片。用真空抽气泵抽气7～8 min，使细胞中的空气被抽出，将叶片全部浸人去离子水中。在室温下静置20 min，然后用DDS-11D型电导率仪测定溶液的电导率R1；再将其置于沸水浴中煮沸15 min，冷却后测定其电导率R2，计算出相对电导率，以此表示细胞膜透性。平行重复3组[5]。

1.3.4 根系活力的测定 取新鲜根样品0.5 g放入烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没，在37 ℃下暗处保温1 h。然后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反应。把根取出，吸干后与乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起研磨。将红色提取液以乙酸乙酯洗涤2～3次，最后加乙酸乙酯定容至10 mL。在485 nm处比色，以空白处理作为参比读出吸光度，根据标准曲线求出四氮唑还原量，以此表示根系活力。平行重复3组[5]。

2 结果与分析

2.1 Cu2+和Zn2+胁迫下润草1号叶片中叶绿素含量的变化

叶绿素是植物进行光合作用的关键因素之一，叶绿素含量水平在一定程度上可以反映植物光合作用能力的强弱；4种不同浓度的Cu2+和Zn2+溶液胁迫对叶绿素含量的作用效果见图1。从图1可见，在Cu2+和Zn2+溶液处理之后，润草1号叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量随着Cu2+和Zn2+溶液浓度的升高均呈现先升高再降低的变化趋势。低浓度的Cu2+和Zn2+处理后，叶绿素含量上升；但当Cu2+浓度≥20 mg/kg或者Zn2+浓度≥50 mg/kg后，叶片中叶绿素含量呈下降趋势。这说明铜和锌是润草1号必需的营养元素，在低浓度下，Cu2+和Zn2+对于润草1号生长具有一定的促进作用。但高浓度的Cu2+和Zn2+却会影响到润草1号叶片中叶绿素的合成，产生了胁迫作用，叶片色素对Cu2+和Zn2+污染的敏感程度高低排序为叶绿素b、叶绿素a、类胡萝卜素。

在高浓度的Cu2+和Zn2+胁迫下，润草1号体内的叶绿素含量呈下降趋势。Cu2+和Zn2+导致润草1号叶片中叶绿素含量下降的原因可能有多种，推测是Cu2+和Zn2+被植物吸收后，细胞内的Cu2+和Zn2+离子作用于叶绿素生成途径的酶；Cu2+和Zn2+离子通过改变叶绿素合成相关酶的正常构型，抑制了相关酶的活性，进而阻碍了叶绿素的合成。有研究表明，早熟禾叶片对光的吸收能力源于其中的叶绿体，而叶绿体的变化过程与叶绿素含量、光合速率降低及其结构的破坏密切相关[6]。因此，在重金属胁迫处理后，会造成叶绿素含量下降及结构被破坏，进而影响光合反应效率，甚至可能影响植物的光合系统、保护酶系统以及物质代谢系统，改变植物正常生理状态，最终导致植物死亡。

2.2 Cu2+和Zn2+胁迫下润草1号叶片中脯氨酸含量的变化

脯氨酸是植物体内调节渗透平衡的重要物质，在维持细胞渗透压方面起着重要的作用，并且植物体内的脯氨酸含量可以用作植物对外界环境重金属胁迫响应的重要指标之一[7]；4种不同浓度的Cu2+和Zn2+溶液胁迫对叶片脯氨酸含量的作用效果见图2。从图2可以看出，在Cu2+和Zn2+胁迫下，润草1号叶片内脯氨酸的含量随着Cu2+和Zn2+浓度的升高不断上升，在Cu2+和Zn2+处理浓度为100 mg/kg时达到最大值，分别为对照的2倍和2.3倍，而且各处理与对照之间差异明显。

2.3 Cu2+和Zn2+胁迫下润草1号叶片细胞膜透性的变化

植物细胞膜系统是植物细胞和外界环境相隔离的屏障，也行使着细胞与外界环境传递信息和交换物质的功能，并且细胞膜的稳定性是维持细胞内外平衡和正常生理功能的基础[8]。重金属胁迫可以破坏细胞膜的稳定性，导致细胞膜透性增加。细胞膜透性的变化会导致细胞膜上结合酶和细胞内酶的失调，使细胞内外平衡性丧失，造成一系列生理生化过程紊乱，甚至出现植株死亡[9]。试验里在Cu2+和Zn2+胁迫处理下，润草1号叶片组织外渗液的相对电导率随Cu2+和Zn2+浓度的增加而升高，呈现出明显的相关性。其原因可能是Cu2+和Zn2+进入润草1号叶片后，与细胞膜蛋白的巯基或磷脂分子层的磷脂类物质反应，造成膜蛋白的磷脂结构改变。而磷脂结构的改变会导致细胞膜结构改变，使得细胞膜透性增大，导致细胞内容物外渗，从而引起相对电导率的变化[3，10]。

2.4 Cu2+和Zn2+胁迫对润草1号根系活力的影响

对于草坪植物来说，发达的根系对于植物抵御外力侵蚀和雨水冲刷、保持水土具有重要的作用。而土壤中的重金属污染最主要的影响就是危害植物根系，可能导致根系活力降低和主动吸收能力下降[11]；4种不同浓度的Cu2+和Zn2+溶液胁迫对润草1号根系活力的影响情况见图4。从图4可见，在低浓度的Cu2+和Zn2+处理下，润草1号根系活力均有升高。在Cu2+和Zn2+处理浓度为5 mg/kg时，根系活力最高，分别比对照提高了70.3%和24.1%，与对照的差异明显。当Zn2+浓度≥50 mg/kg、Cu2+浓度≥20 mg/kg时，润草1号根系活力开始下降。在Zn2+、Cu2+处理浓度为100 mg/kg时，根系活力最低，分别为对照的52.7%和26.5%，与对照差异明显。由图4还可见，低浓度的Cu2+和Zn2+（<20 mg/kg）能够提高润草1号根系活力，这表明低浓度的Cu2+和Zn2+对润草1号根系的生长及生理具有一定的促进效果；但当Cu2+和Zn2+的处理浓度为20 mg/kg后，润草1号的根系活力则呈下降趋势，浓度越高，根系活力越低。究其原因可能是高浓度的Cu2+和Zn2+胁迫后，产生的自由基超过润草1号自身抗氧化系统酶的清除能力，多余的自由基会对润草1号根系代谢中的琥珀酸脱氢酶等造成伤害，从而使根系活力下降[11]。

3 小结与讨论

试验结果表明，Cu2+和Zn2+胁迫处理对润草1号初期生长的影响并不完全一致。高濃度的Cu2+对叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞膜透性及根系活力抑制作用明显，并且这种抑制作用均随着Cu2+胁迫浓度的增加而增强，对根系生长的抑制尤其明显。Zn2+胁迫处理对叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞膜透性及根系活力的影响与Cu2+有相似之处。但是Zn2+胁迫的抑制程度要明显小于Cu2+处理。

叶绿素含量的多少在一定程度上反映了植物光合作用的强弱，也直接影响着草坪植物的绿度。试验中2种重金属Cu2+和Zn2+对润草1号叶片中叶绿素的影响表现出相类似的规律，当处理浓度低于20 mg/kg时，Cu2+和Zn2+对叶绿素合成具有促进作用，叶片中的叶绿素含量比对照有所增加；当处理浓度等于20 mg/kg时，Cu2+和Zn2+对叶绿素合成具有抑制作用，叶片中的叶绿素含量随处理浓度的增加而减少。个中原因可能是高浓度的Cu2+和Zn2+会抑制润草1号合成叶绿素途径的关键酶活性，影响叶绿素的合成，导致了叶片中叶绿素含量的下降[12]。

草坪植物绿度与根系生长是衡量草坪植株是否具有实际应用价值的最为重要的指标之一，而高浓度的Cu2+和Zn2+对“根系生长的抑制作用尤为明显。因此，在实际使用中，建议草坪土壤中的Cu2+含量应控制在10 mg/kg以下，Zn2+含量可以控制在20 mg/kg以下，以利于润草1号植株的正常生长。

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