分子生物学技术在白血病诊断中的应用

孙园园　徐琳琳

【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）02--01

白血病是一种常见的基于造血干细胞恶性发生的肿瘤疾病。据报道，在中国地区白血病的死亡率占恶性肿瘤中的第六位，死亡率占儿童肿瘤的第一位。白血病是一组临床异质性疾病，根据患者年龄不同，细胞形态、细胞遗传学异常程度不同预后和存活率有显著差异，因此对于白血病早期诊断，准确评估和治疗都有很重要的意义。传统白血病诊断方法以形态学检测为主要手段，由于其主观因素影响大，速度慢，精度、重复率不高，容易误诊或漏诊。现代诊断方法为形态学、免疫学、分子生物学和遗传学综合诊断，即MICH方法。随着临床研究的不断深入，分子生物学技术以其简单，快速，敏感，特异，试剂稳定，危害性小的显著优势，在诊断、治疗白血病，监测微小残留病的应用中发挥了重要作用，为白血病精细分层[1]实现个体化治疗[2]，提高患者的治疗效果提供了重要依据。应用于白血病的诊断分子生物学技术已经成为一个热门话题，在本文中，将对最近白血病在分子生物学技术诊断方面的研究进行讨论。

1.白血病的发病机制

现代研究显示，环境因素和遗传因素是造成白血病的主要发病机制。由于电离辐射，化学致癌物，病毒等环境因素引起的遗传物质染色体和基因的突变，癌基因点突变激活和肿瘤抑制基因的失活、损耗也是很重要的发病机制。有些患者可由一些血液疾病发展为急性白血病。

2.诊断方法

目前，大多数涉及白血病的相关基因已被克隆，通过直接或间接检测这些融合基因可以进行白血病的分子诊断。特定染色体异常和基因的突变可作为诊断疾病的发展和预后的重要指标。目前较为常用的分子生物学诊断技术有荧光原位杂交（FISH），实时荧光定量PCR（QR-PCR）、比较基因组杂交（CGH），基因芯片和全基因组测序[3]。

2.1 荧光原位杂交（FISH）

FISH是1980年后发展起来的一种间接基因定位方法。该法采用标记的单链DNA探针与其互补的DNA发生退火、杂交，通过观察染色体上的荧光信号，来检测分裂中期或间期细胞上的核 DNA 位置反映相应基因的状况，可应用于临床各种标本的检测。由于其直观，快速，灵敏，方便灵活，可量化，在白血病的诊断，治疗监测，预后和检测微小残留疾病等方面正成为一种不可缺少的重要手段。[4][5]

目前，常用的商品化单序列探针有PML-RARα[t（15；17），见于M3，AML1-ETO[t（8；21），见于M2b]，BCR-ABL[t（9；22），见于CML和ALL]，TEL- AML1[t（12；21），见于儿童前B-ALL]等已经应用于临床。临床常采用多标记探针，可以大大提高检测效率，multicolor-FISH与现代高通量方法对确定新肿瘤相关基因组区域有影响研究。[6]

Soriani S等[7]介绍了微波荧光原位杂交技术，它是一种新的快速检测PML-RARα重排的实验室诊断方法，30 min即可获得结果。结合了细胞快速收获，荧光原位杂交和微波束三种技术，大大提高了檢测效率。

2.2 实时定量PCR（RQ-PCR）

RQ-PCR技术是在常规PCR反应体系中添加了荧光染料或荧光标记探针，然后进行PCR过程，检测体系中荧光强度的变化。根据标准物质的CT值（即在PCR扩增过程中，PCR启动后荧光信号由本底进入指数生长期的拐点对应的周期数目）建立标准曲线，然后通过标准曲线对待检模板进行评估定量分析。RQ-PCR[8]作为新兴的精确基因定量技术，灵敏，特异，技术成熟，操作简便，重复率较高，Dolz S等[9]发现是AML重组融合基因的灵活和敏感可靠的筛选试验方法。评估治疗反应、检测癌细胞的数量，对监测MRD具有很大意义[10]。以此作为临床诊断、评估检测标准，对患者及早进行临床干预，从而指导后期治疗，进而提高长期生存率有重要的临床价值。

Malik D等[11]报道他们采用RQ-PCR研究儿童急性淋巴白血病时发现一种新分子miR-2909-KLF4轴，通过它能够区分儿童急性B细胞和T细胞白血病，这可作为一种新的诊断或预后评估的标记。

Bennour A[12]等通过分析45例阳性慢性粒细胞白血病，采用多重RT-PCR分析，结果快速、可靠。

2.3 比较基因组学

比较基因组杂交（CGH）1992年提出的，是用于检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的有力的工具。虽然CGH分析不能提供有关染色体变异的精确信息，但它不需要肿瘤组织培养或核型分析。

曹琪等[13]研究表明CGH是一种快速、简单和有效的方法，可用于检测ALL中大片段染色体区域或染色体数目的改变。特别适用于染色体培养失败及形态差的情况。然而，CGH的应用范围有其局限性，只有与常规细胞遗传学分析、FISH和其它分子生物学工具相结合，才可以全面地阐明基因组的异常。

李莉[14]研究的微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，array CGH）是一种高分辨率、高通量、高效率的全基因组筛查技术，可以检测到亚显微染色体的异常、精确定位，有效地弥补了现有方法的局限性，在非平衡染色体畸变方面作用显著。

2.4 基因芯片技术

基因芯片技术[15]是一高通量的基因检测技术，具有高灵敏度和精确定量检测的优势，有很好的应用前景，近几年得到越来越多的研究。在白血病基因检测中，有利于白血病融合基因的发现和监测微小残留病的监测，追踪同一患者中多个融合基因、治疗中融合基因变异等情况。基因芯片是新一代分子诊断试剂的主要发展方向。目前，基因芯片技术大规模的临床应用还存在着缺陷，基因芯片临床诊断还未实现，尚处于探索研究阶段。现存在于市面上的主要是低灵敏度和较差特异性的诊断芯片。由于基因芯片技术上仍需攻关和辅助诊断设备昂贵等原因，预计定量PCR技术在未来一段时间内仍占主导地位。

3.結束语

分子生物学技术具有高效，灵敏，特异性好的优势。不同的诊断方式有不同的优缺点，综合运用对于复杂或特殊白血病的诊断具有很好的效果。[16][17]

在人类基因组计划的基础上，随着对白血病研究的逐步深入，白血病的异质性融合基因和特异性片段越来越多的被发现，遗传信息的深入和高通量的诊断技术的发展会导致越来越多的分子靶标将被应用于血液疾病的预防，预测，诊断，治疗和评估。近年来的热门研究miRNA与肿瘤的相关性也在血液肿瘤学方面有了重要发现。Ahmad N 等[18]发现miRNA的失调与肿瘤的起始事件的推动密切相关，可作为多发性骨髓瘤（MM）转移和耐药性评估的重要指标。

分子生物学技术检测的标准化是影响该技术诊断效果的重要因素，制定标准规范的临界值，选择特异、灵敏、标准化的分子标记[19]都将是影响分子生物学技术在白血病诊断中的关键。

参考文献

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