慢性髓系白血病伊马替尼耐药相关miRNA的研究进展

陈 晨 综述，李 卫 审校

(广西医科大学第一附属医院儿科，南宁 530021)

·综 述·

慢性髓系白血病伊马替尼耐药相关miRNA的研究进展

陈 晨 综述，李 卫△审校

(广西医科大学第一附属医院儿科，南宁 530021)

微RNA；慢性髓系白血病；伊马替尼；耐药性

慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一类以BCR-ABL酪氨酸激酶原癌蛋白表达为特征的骨髓增殖性肿瘤，CML患者存在Ph染色体易位,22号染色体上的裂点簇集基因(BCR)融合到9号染色体的ABL-1基因上，能够产生BCR-ABL融合蛋白，再由这种融合蛋白激活ABL-1激酶，ABL-1激酶可诱导多个信号通路开放，抑制髓细胞凋亡，并促进其增殖。治疗CML最常用的化疗药物是酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)，作用机制是抑制BCR-ABL原癌蛋白酶的活性，伊马替尼是这类药物的代表之一[1-2]。 伊马替尼是第一个合理设计的抗癌药物，在延缓疾病进展和缓解症状方面非常有效[3]。但是由于BCR-ABL复制或突变，导致激酶活性升高或伊马替尼无法与靶目标结合，会出现伊马替尼耐药[4]。近年来发现CML的进展和对TKIs耐药的产生与miRNA密切相关。本文就CML伊马替尼耐药与微RNA (microRNA，miRNA)的研究进展综述如下。

1 miRNA概述

miRNA是由18～25个核苷酸组成的进化上保守的单链非编码RNA分子。自1993年Lee 等[5]在秀丽隐杆线虫(C．elegans)中发现第一个miRNA以来，miRBase数据库的miRNA数量不断增长。miRNA已被证实可作为生物调节器参与许多细胞生理过程，如分化、增殖和凋亡等。miRNA是由细胞核内基因组DNA编码，RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录成初级miRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA经Drosha核酸酶剪切成长约68～80个核苷酸长度的具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。再由转运蛋白5转运至细胞间质，随后Dicer核酸酶将其剪切成20～25个核苷酸组成的成熟miRNA。miRNA与目标mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)结合，通过RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)使目标mRNA翻译抑制或稳定性降低[6-7]。由于单个miRNA可以针对几个mRNA，因此，一个mRNA的3′-UTR可包含几个miRNA识别信号，目前至少有10%～40%的人类mRNA已被确定为miRNA的靶目标[8]。事实上，一个miRNA可有多达200个目标基因，这些目标基因的功能多种多样，包括转录、分泌激素、受体和转运蛋白等，因此，miRNA可能控制着人类大约1/3的mRNA表达[9]。

2 miRNA与CML

过去几十年里，miRNA已经被确认为是参与人类疾病发生、发展的一个重要因素[10]。有研究表明，大约50%的miRNA基因位于肿瘤相关的某些基因组区域或脆性位点上[11]。在肿瘤组织中，有些miRNA表达上调，而有些则下调，这些miRNA起到类似于抑癌基因和癌基因的作用。近年来在许多白血病亚型的起始和进展中均观察到miRNA的差异表达。Calin等[12]发现miRNA15和miRNA16位于染色体13q14区域，超过一半以上的B淋巴细胞白血病与该区域的缺失相关，研究表明在大约68%的慢性淋巴细胞白血病(CLL)病例中，miRNA15和miRNA16缺失或者表达下调。Rokah等[13]采用微阵列分析和RT-PCR检测miRNA在CML中的表达水平，发现miRNA-31、miRNA-155和miRNA-564在CML中表达下调。miRNA-128在大脑组织中表达丰富，研究表明它的异常表达与胶质瘤、白血病等疾病密切相关，参与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等过程[14]。有研究显示，大量miRNA基因在造血功能中参与多种通路的调节，其异常表达可促进CML发生和发展[13]。Li等[15]发现在CML细胞和CML患者中，miRNA-125b的表达显著增加，miRNA-125b可通过调节靶基因BAK1的低表达，参与线粒体凋亡途径，表明miRNA-125b可靶向作用于BAK1，参与慢性粒细胞白血病的转移。已经发现大量的miRNA参与调节CML及其他们癌症，并通过各种机制参与癌症进展，重要的是，一些癌症相关的miRNA目前被认为可作为生物标志物用于患者的预后和药效评价[16]。Li等[17]研究发现，miRNA-4701-5p在KCL22,K562和 KU812中的表达相较它们的耐药细胞明显降低，miRNA-4701-5p通过靶向作用于ST3GAL1，参与CML细胞多药耐药。研究表明，miRNA-1301可以靶向作用于RanGAP1的3′-UTR。此外，CML患者中发现RanGAP1的表达水平与miRNA-1301呈逆相关，RanGAP1蛋白下调或miRNA-1301表达水平上调均可提高CML细胞对伊马替尼的敏感性。实验室数据显示，miRNA-1301通过下调RanGAP1的表达，可诱发BCR-ABL核压迫和p53转录激活从而提高伊马替尼对CML细胞的疗效[18]。

3 miRNA与CML耐药

3.1 miRNA-217 越来越多的证据表明异常的表观遗传在CML中参与抗酪氨酸激酶,导致白血病细胞克隆和疾病传播[19]。Nishioka等[20]发现长期应用BCR-ABL TKI治疗导致的K562细胞耐药与DNA甲基化水平增加和miRNA-217水平下降有关。通过观察BCR-ABL TKI耐药的Ph染色体标记的急性淋巴细胞白血病(ALL)和CML患者的白血病细胞样本，发现DNMT3A表达水平增加与miRNA-217下调有关。进一步研究K562 TKI耐药细胞发现，由于miRNA-217可与DNMT3A的3′-UTR结合，因此，控制miRNA-217的表达量能抑制DNMT3A的表达水平。值得注意的是，通过在体外上调miRNA-217和下调DNMT3A，长期应用达沙替尼、5-A-za-dc联合治疗的K562细胞增殖受到抑制。此外，观察患K562肿瘤的小鼠发现在应用达沙替尼、5-A-za-dc联合治疗后，DNMT3A表达水平下降，miRNA-217表达水平增加。综上所述，Ph+白血病细胞和CML获得性TKI耐药与miRNA-217上调和DNMT3A下调密切相关。Nishioka等[21]研究CML患者骨髓单核细胞中的EZH2水平时发现，通过STAT5通路过表达EZH2，K562DR细胞可抵抗耐伊马替尼介导的生长抑制，因此EZH2的过表达可能是导致白血病细胞伊马替尼耐药的因素。相较亲代K562细胞，在K562DR细胞中miRNA-217的表达降低，因此，miRNA-217的低表达可能与CML伊马替尼耐药相关。

3.2 miRNA-17 Firatligil等[22]通过茎环聚合酶链反应(stem-loop PCR)对伊马替尼敏感细胞、伊马替尼耐药细胞和健康捐赠者的外周单核细胞样本进行分析，发现miRNA-17具有致癌活性，并能下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1a(cyclin-dependent kinase inhibitor 1a,CDKN1a)、p21和E2 transcription factor 1(E2F1)等肿瘤抑制因子。在K562伊马替尼耐药细胞的药物实验中发现，分别应用伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼等药物干预后，miRNA-17的表达水平下降，这些数据说明miRNA-17可能成为CML患者治疗的重要手段。Jurkovicova等[23]应用微阵列芯片技术和qRT-PCR等方法分析伊马替尼耐药和敏感患者的70种不同的miRNA，结果发现伊马替尼耐药患者的miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-21、miRNA-27a和miRNA-155表达量增加。miRNA-17～92集群有助于细胞增殖，并通过E2F1、磷酸脂酶基因(PTEN)和BCL2介导的细胞凋亡因子(BIM)等转录因子抑制细胞凋亡。Liu等[24]研究发现，在K562细胞中，miRNA-17明显下调,且由原癌基因激活并在白血病发展中执行原癌基因的部分功能。原癌基因或miRNA-17的过表达可缓解氯化两面针碱(NC)诱导的细胞分化和凋亡，NC可增强伊马替尼在K562和原代CML细胞中的作用。CML伊马替尼耐药细胞株K562/G01和CML原代细胞对NC表现出高度敏感。NC通过c-Myc-miRNA-17调节轴促进红细胞分化和凋亡,为克服伊马替尼耐药提供潜在可能。

3.3 miRNA-181a/b/c Zimmerman等[25]研究发现，miRNA-181b可直接抑制髓样细胞白血病-1(Mcl-1)的表达，miRNA-181的减少可导致Mcl-1表达水平提高和耐药性增加。Mosakhani等[26]对CML(4例伊马替尼耐药患者和5例伊马替尼敏感患者)患者的骨髓活检样本进行miRNA微阵列芯片技术和qRT-PCR分析发现，伊马替尼耐药/敏感细胞中miRNA-181c的明显下调和某些miRNA-181c靶向基因(如pre-PBX3、HSP90B1、NMT2和RAD21)与药物应答相关。Wang等[27]研究发现，K562细胞内miRNA-181a的过表达可提高CML细胞对伊马替尼的敏感性，靶向作用于BCL2可能是miRNA-181a促进K562细胞伊马替尼诱导细胞凋亡的新机制。

3.4 miRNA-219-2和miRNA-199b CML的发生是由于t(9，22)(q34;q11)和分子BCR/ABL基因融合。大约15%～18% Ph+的CML基因缺失患者易位断点位于9q34.1。由于在CML患者中相继发现miRNA-219-2和miRNA-199b(ABL1基因的着位点)的缺失，Joshi等[28]为了证实9q的缺失，应用荧光原位杂交试验(FISH)和RT-PCR分析了150例CML患者的标本，发现9q34.1在34例CML患者中缺失，与无9q缺失的患者比较，9q缺失患者的miRNA-199b和miRNA-219-2呈低表达，miRNA-199b相较miRNA-219-2显著下调。随后发现，44.11%的患者对伊马替尼表现出耐药。Flamant等[29]研究发现，在CML患者经过伊马替尼治疗两周后，miRNA-150和miRNA-146a表达上调，而miRNA-142-3p和miRNA-199b-5p表达下调，增加miRNA-199b的表达可能会抑制CML细胞的Notch信号发挥作用，有利于增加他们的增殖活性。因此，miRNA-219-2和miRNA-199b与CML伊马替尼耐药密切相关。

3.5 miRNA-29a/b miRNA-29a/b在CML中持续低表达，其表达水平与伊马替尼临床耐药相关，已成为一个药物应答的潜在生物标志物。有研究采集了应用伊马替尼治疗超过12个月的患者血样本，采用Q-RT-PCR检测发现，miRNA-29a在耐药患者的血样本中呈低表达，并且与CML预后不良密切相关[30]。 Li等[31]对miRNA-29b进行了深入研究，通过荧光素酶试验观察到miRNA-29b结合于ABL-1的3′-UTR，在K562细胞中，miRNA-29b通过过表达激发p21和p27因子，降低ABL-1蛋白水平，导致G1期细胞分裂阻滞。同时，外源性miRNA-29b也可诱导细胞凋亡增加和半胱天冬酶3活性增强，导致PARP分裂和Bax凋亡因子表达增加，其在CML细胞系中慢性期和急变期均一致下调。Riether等[32]研究发现，在CML干细胞中通过下调miRNA-29，TKIs可诱导肿瘤坏死因子家族配体CD70的表达，从而减少CD70启动子DNA甲基化和上调转录因子的特异性蛋白1。表明miRNA-29b是一个潜在可用于诊断的生物标志，并有望成为伊马替尼药物反应的预测因子。

3.6 其他miRNA Ferreira等[33]研究发现，miRNA-146a的高表达可参与由BCR-ABL诱导的NF-κB信号传导的抑制，从而促进在伊马替尼耐药细胞的凋亡。Kaymaz等[34]发现，沉默STAT5A 基因可以改变耐药细胞中miRNA-2278的表达，通过上调miRNA-2278的表达，伊马替尼耐药细胞的凋亡明显增加，从而恢复CML对化疗的敏感性。Liu等[35]发现在K562耐药细胞中c-myc的表达上调，c-myc可增加miRNA-144/451的表达。更重要的是， miRNA-144/451的恢复或c-myc的敲除可增加伊马替尼耐药细胞对凋亡的敏感性。myc，miRNA-144/451形成的调节通路可参与调节伊马替尼耐药。Lin等[36]分别采集了CML 伊马替尼敏感患者、CML伊马替尼耐药患者和健康捐赠者的骨髓，3种骨髓标本的CD34+CML干/祖细胞中均发现了miRNA的表达。Bioconductor Illumina公司对标本中的CD34+细胞进行深度测序(deep sequencing，DESeq)发现了63种不同miRNA的表达。值得注意的是，在伊马替尼敏感组和耐药组的CD34+细胞样本中有12个miRNA的表达不同，相较于健康捐赠者的CD34+细胞样本，大多数miRNA表达降低，17个miRNA表达增加。此外，在CD34+CML干/祖细胞中发现了34个新的miRNA。该团队随后使用高产量量化微流体装置验证了这3组骨髓标本CD34+的测序数据。此研究证实了CD34+细胞中63个已发现miRNA中有32个miRNA的不同表达，包括致癌活性因子miRNA-145、miRNA-151、miRNA-452表达水平下降。另外，他们发现23例CML患者在经过尼洛替尼规范化治疗后，13例患者CD34+细胞中miRNA的表达有明显变化。这些差异表达的miRNA大多在细胞周期中起调控作用，参与MAPK和factor-β信号通路。因此，CML患者干/祖细胞中差异表达的miRNA和目标基因可能可以作为预测CML患者对伊马替尼临床治疗效果的生物标记。

4 展 望

综上所述，miRNA通过调节转录后mRNA的表达水平，参与CML的对伊马替尼耐药性的产生过程，不同的miRNA对CML伊马替尼耐药性会产生不同的影响，通过上调或下调某些miRNA的表达可促进CML伊马替尼耐药细胞的凋亡，从而降低CML对伊马替尼的耐药性，这些miRNA有望成为降低CML患者伊马替尼耐药的潜在治疗靶点。但是，由于某些miRNA对CML伊马替尼耐药性产生的作用机制还未清楚，而且miRNA比较难以转入细胞内，目前还无法作为药物用于临床。此外，miRNA可调节多个基因，可能会导致非预期的不良反应和风险，也可能成为限制其临床应用的因素之一。

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陈晨(1989-)，医师，硕士研究生，主要从事血液病研究。△

，E-mail:liwei60@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.041

R733.72

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1671-8348(2017)09-1277-04

2016-08-03

2016-11-01)