利用干细胞进行心血管修复和再生的潜力与挑战

安 琳 综述，魏 兰，杨晓容 审校

(1.陆军重庆军事代表局门诊部 400060； 2.重庆市血液中心 400015；3.重庆市食品药品检验检测研究院 401121)

利用干细胞进行心血管修复和再生的潜力与挑战

安 琳1综述，魏 兰2△，杨晓容3审校

(1.陆军重庆军事代表局门诊部 400060； 2.重庆市血液中心 400015；3.重庆市食品药品检验检测研究院 401121)

心血管疾病；心肌修复；胚胎干细胞；成体干细胞；间质干细胞；造血干细胞；内皮祖细胞

随着人口逐渐老龄化，心血管疾病成为威胁人类健康的重要疾病，尽管有许多药物治疗心血管疾病，但其仍然是老年人的主要死因[1]。文献研究表明，超过500万慢性心力衰竭患者因得不到有效治疗而转为急性心肌梗死[2]。因此，探寻有效治疗心血管疾病的方法意义显著。心血管再生治疗方案的提出为心血管疾病的治疗提供了新方向，该方案主要通过修复或再生受损的心肌或(和)血管来重建或恢复心脏功能[3]。这种新兴治疗方案与传统以缓解症状为主的方案相比有巨大的优势。传统治疗方法能够有效治疗心脏病患者的急性病变并延长患者生命周期，但并不能完全治愈患者，而使其患上慢性心脏病的后遗症[4]。相反地，心血管再生方案利用患者特异性多能干细胞分化成心肌细胞来修复受损的心肌，避免了前面提及的医学问题，还能阻止或者逆转病情的发展[3]。研究证明，干细胞治疗对许多心脏病均是有效的，如缺血性心脏病[5]、心力衰竭[6]、动脉粥样硬化[7]、肺动脉高压等[8]。

干细胞具有分化成多种特异型细胞的潜能，按其来源分为胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(adult stem cells,ASCs)，前者来自于胚胎而后者起源于成熟个体[9]。ASCs可以分化成组织特异性干细胞和骨髓干细胞(bone marrow-derived stem cells,BMCs)。骨髓包含至少两种干细胞类型：造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在骨髓中也被发现[10]。本文对不同干细胞的特性及它们还原或修复心脏结构和功能再生的能力进行综述，以期为心血管疾病的治疗提供理论依据和新思路。

1 ESCs

心脏干细胞治疗的目的是恢复或再生心肌。如何选择合适的干细胞来源，使其产生足够的具有心肌细胞的表型是非常有挑战性的。过去的十多年里，人们对干细胞的识别、衍生及特性描述方面有了飞速发展。在各种干细胞中，ESCs由于其独特的性质而受到关注。ESCs是从囊胚期胚胎的内皮细胞团分离出来的多能干细胞。这些细胞在培养过程中长时间处于未分化状态，但保持了分化成人类各种细胞(如心肌细胞)的潜能。人们对利用这些永生化多能细胞治疗先天性和退行性疾病表现出极大的兴趣。从大量研究中认识了一些与心肌早期分化相关的信号分子，如过表达转录因子[如锌指蛋白(GATA4)，同源盒基因(Nkx2-5)或肌细胞增强子2C(MEF2C)]可以诱导人ESCs分化成心肌细胞,而抑制这些转录因子则能阻止细胞的形成[11]。其他一些因子如转化生长因子β1(TGFβ1)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)，活性氧和二甲基亚砜也能影响这一分化过程[12-13]。

尽管在老鼠和人类模型中，已经成功地将ESCs分化成心肌细胞，但仍有一些棘手的问题使其不能应用于临床。(1)获得人类ESCs需要破坏人类早期胚胎，这严重违反伦理道德。(2)ESCs源于胚胎，与患者的基因组不尽相同，因此在移植后存在免疫排斥反应的风险[14]。(3)移植ESCs到老鼠体内只能产生少量的心肌细胞，在人类模型中数量更少[15]。(4)体内移植人ESCs也可能导致畸胎瘤。尽管由ESCs引起的肿瘤恶性程度还不明确，但这一发现仍然令人担忧其临床应用的安全性[16]。而使用人源诱导的多能干细胞(human inducible pluripotent stem cells，hiPSCs)能克服ESCs的这些局限性，而且不会涉及伦理道德问题。一些研究小组已经对比了人源胚胎干细胞(hESCs)和hiPSCs及其分化后代。Laurent等[17]报道hESCs和hiPSCs具有相似程度的基因不稳定性，因此，在评价它们在心血管修复和再生能力前需要作更深入的研究。此外，有报道显示hESCs和hiPSCs分化成心肌细胞的能力不同[18]。

2 ASCs

在临床上运用人源ESCs会有政治、种族和技术上的担忧。最近在ASCs方面的研究发现:其可能有希望替代hESCs进行细胞水平的治疗[3]。使用ASCs能够避免使用hESCs产生的伦理道德和宗教争议。它们从分离出来就具有和患者相同的基因型，可以最小化免疫排斥反应[19]。因此，要从细胞水平上修复或再生心血管使用ASCs似乎更合适。此前，一直认为心脏是一个缺乏自我更新能力的终末分化器官，然而最新证据表明，存在内源性心肌干细胞(cardiac stem cells，CSCs)能够分化出新的细胞和血管[20]。事实上，只有少量的CSCs(每1 000个心肌细胞中有1个)分布在心房、心室和心外膜中。在生理条件下，CSCs处于失活状态并且脱离细胞周期，只有2%～3%处于激活分化状态来维持正常心肌功能。但是，在局部缺血或细胞损伤等生理或病理条件刺激下，大部分CSCs均能被激活并且分化成新的心肌或血管细胞[21]。尽管已有实验证明在心肌梗死中，注入CSCs可以产生新的心肌细胞来取代坏死细胞[20]，但CSCs在自然状态下再生能力太弱，无法应用于临床，因而需要在体外进行扩增。只要得到有效刺激，使用这种来源于心肌的干细胞进行心肌细胞的修复和替换具有巨大优势。但是，如何从心肌样本中取得并分离CSCs是主要难题。另外，CSCs增殖和分化成心肌细胞的分子机制还未被阐明。尽管有大量相关研究，但它们并没有在CSCs的识别、更新及再生能力方面达成共识。因此，在这些所有的限制条件被适当解决前，应用CSCs治疗心血管疾病仍有待继续研究。

3 MSCs

MSCs是一类具有成纤维细胞特性的亚型细胞，具有分化成不同的中胚层细胞的潜能(如成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞)[22]。在1例主要组织相容性复合体(MHC)错配的小鼠心脏移植模型中，MSCs可以诱导免疫耐受和长时间的不排斥,这一免疫抑制效应是通过抑制树突状细胞成熟，抑制T、B和自然杀伤细胞功能等实现的[23]。而移植的MSCs也可分泌旁分泌因子，从而调节免疫系统和炎症反应[22]。这些独特性质使得MSCs能在组织修复和基因导入等病例中允许同种异体移植而无需免疫抑制药物，因此将会在免疫医学受到青睐。

MSCs因其自我更新、增殖、分化能力，是一个理想的替代细胞来源。有研究表明，将人MSCs直接注入成年老鼠左心室能有效嫁接于心肌并分化成心肌细胞，并且与本体心肌细胞在形态学上无法区分[24]。值得关注的是，MSCs也能通过促进邻近细胞的旁分泌来促进其生长和增殖。 MSCs能分泌不同的调控和营养因子(如生长因子，细胞因子、趋化因子)，能进入循环系统到达受损原发灶，或者通过其再生和旁分泌功能参与伤口愈合过程中炎症反应[25]。此外，MSCs也有一些其他特性促进其临床应用，如扩张潜能，易于获得，体外传代时易感基因突变率低。

4 HSCs

HSCs是成人造血的基础，能在生命周期内产生所有类型的血细胞。HSCs在治疗白血病和血液相关遗传病方面具有显著的临床意义。HSCs被认为是一种多能干细胞，能够分化成许多类型的细胞，包括心肌细胞和内皮细胞。HSCs能够在骨髓和外周血中被分离出来，但循环系统的含量少于骨髓。在正常情况下，骨髓中休眠的HSCs水平是有限的(每1 000个骨髓细胞中含有1个)[9]。在病理或生理条件的刺激下，这些干细胞能迅速增殖，并从骨髓区域转移到外周血循环，到达受损部位[10]。鼠源祖细胞没有特异性的表面标志物，而人源HSCs表达CD34和AC133特异表面标志物，这些标志物能够帮助人们进行阳性筛选和分离。人的脐带血相对有丰富的HSCs，此外，造血祖细胞也在人胚胎肝脏中被分离出来。有报道显示，HSCs可通过骨髓依赖机制促进心肌细胞生成[26]。利用HSCs进行心血管修复能满足干细胞移植的目的，即肌细胞生成和血管生成。但是，需解决HSCs不易获得和培养的问题，阐明调控其增殖和分化的分子机制[9]。另外，特异性诱导HSCs分化成心肌细胞还必须要避免肿瘤的发生。

5 EPCs

有研究报道， EPCs及其派生物在心血管疾病方面具有治疗潜能，EPCs能分化成内皮细胞并参与产后血管生成[27]。EPCs起源于骨髓，也存在于外周血和脐带血[10]。在正常情况下，外周血和骨髓中EPCs的含量稀少，因此很难在体外扩增出足够的EPCs用于临床[9]。有研究报道EPCs属于血管生成细胞，能在缺血或外源性细胞因子刺激下移动到缺血部位，参与修复和维持血管平衡，因为它们能替代并修复受损的内皮细胞[28]。在心脏研究领域中，EPCs在心肌缺血或细胞因子的刺激下，能通过增加循环细胞的数量，到达受损部位并分化成新的心肌细胞[29]。EPCs具有循环、增殖和分化为成熟内皮细胞的能力，但是既没有成熟的内皮标志物，也不能形成内腔[30]。

6 展 望

利用干细胞进行心血管修复为临床治疗心血管疾病提供了新思路，然而在选择合适的干细胞进行心血管组织再生和功能修复中面临很多问题。以下问题必须纳入考虑：如何获得充足的干细胞；如何提高体外扩增效率；目标干细胞移植入人体的最佳实施方案；目标干细胞在人体内的分化效率和功能整合。基于前面所论述的限制，获得足够的ESCs是有挑战的。相比之下，分离BMCs(如HSCs、MSCs、EPCs)相对比较容易，因为它们既存在于外周血，也存在骨髓。

由于在体内直接分离获得的干细胞数量极其有限，因此，可将这些目标干细胞进行体外分离和纯化以促进其利用率。利用体外扩增，移植前必须确保所筛选的细胞具有心肌细胞性质，心肌细胞应该具有自律性并表现出动作电位。早期心肌细胞可能会有不成熟的动作电位特性，但是随着培养时间的延长，其功能会逐渐成熟。人们曾经尝试过3种方法将干细胞导入心血管系统(静脉、冠状动脉和心肌)。将干细胞移植到心脏可以通过冠状动脉或冠状窦路径，也可直接利用心内膜映射仪器直接将心肌细胞导入到心肌内部[28]。此外，骨髓源性的细胞可以采用静脉注射，而将这些细胞靶向受损心肌可以采用特异性标志物。为了确定干细胞移植的最佳方案，非常有必要在心肌梗死的动物模型中比较这3种方法的优劣。部分临床试验表明，移植的干细胞可能无法完全取代心肌细胞的功能。改善心功能也可以通过其他方法，比如由移植细胞的旁分泌效应调控激活残余心肌的功能，或者增强内源性修复过程[19]。由干细胞分化而来的心肌细胞的结构和功能特性，以及它们整合到宿主组织的能力仍然有待研究。

综上所述，通过干细胞进行心血管修复和再生还有很长的一段路需要走，还有很多问题亟待解决：(1)确定这些细胞是否具有成熟心肌细胞的结构蛋白，如肌节、肌动蛋白α(α-actin)、心肌钙蛋白、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链等。(2)还应研究这些细胞的离子通道和动作电位传播所涉及的电生理学。(3)为了确定干细胞移植能否恢复，维持或改善受损心肌功能，有必要评估一些临床指标，如心泵出功能、冠状血流量、心脏重塑等。当然，干细胞治疗的不良反应也需要被充分评估，从而更好地指导未来临床运用。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.039

安琳(1972-)，主管护师，本科，主要从事心血管疾病治疗相关研究。△

，E-mail:weilanpostbox@sina.com。

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1671-8348(2017)07-0985-03

2016-07-18

2016-11-16)