17β-雌二醇降解菌红球菌(Rhodococcussp.)DS201的分离鉴定及其特性研究

于清淼，王 平，刘东波，赵洪岩，邵缓缓，马 喆，霍洪亮

(1.东北师范大学环境学院，吉林 长春 130117；2.南京大学环境学院，江苏 南京 210023；3.东北师范大学生命科学学院，吉林 长春 130024)

17β-雌二醇降解菌红球菌(Rhodococcussp.)DS201的分离鉴定及其特性研究

于清淼1，2，王 平3，刘东波3，赵洪岩3，邵缓缓1，马 喆1，霍洪亮1

(1.东北师范大学环境学院，吉林 长春 130117；2.南京大学环境学院，江苏 南京 210023；3.东北师范大学生命科学学院，吉林 长春 130024)

从北京一药厂曝气池的活性污泥中驯化、分离得到一株能以17β-雌二醇为唯一碳源生长的高效降解菌DS201.经过对其进行形态学、生理生化和16S rDNA序列分析，初步鉴定为红球菌Rhodococcussp.分析了温度、pH值、接种量、底物浓度等因素对DS201生长的影响.结果表明：DS201生长的最适温度为30℃，最适pH=7，最佳接种量为2%，最适底物浓度为5 mg/L.通过正交实验分析，DS201降解17β-雌二醇的最优条件是：温度30℃，pH=7，接种量为1%；培养3 d能使1 mg/L 17β-雌二醇完全降解.通过质谱分析，17β-雌二醇的初级降解产物是雌酮.

17β-雌二醇；红球菌属；生物降解；雌激素活性

17 β-雌二醇(17 β-estradiol，E2)是一种天然雌激素，也是典型的环境内分泌干扰物，在我国内陆水系和近海水体中均能检测到其存在.长江和太湖中E2浓度都在0.1 ng/L以上[1-2].天然雌激素污染对人或动物生长、发育危害极大.对水生生物的影响表现为雄性雌性化或雌雄同体、发育异常甚至死亡等.对人的影响表现为神经系统、免疫系统发育异常和生殖障碍，致畸和致癌等[3-5].Biegel等[6]的研究发现，生活在E2污染环境中的成年小鼠卵巢和睾丸发育均不正常；Vajda等[7-9]研究发现，生长在含有E2废水的鱼类出现生殖异常.此外，有研究还表明，E2污染与女性乳腺癌和男性前列腺癌、睾丸癌发病率的增加都有直接关系[10].

在众多的天然雌激素中，E2被认为是潜在的危害最大的一类雌激素，主要通过人和生物体的尿液以及工厂废水排放进入环境中，极低浓度水平(0.l ng/L) 的 E2便可造成明显的影响[3，7].目前，降解污染水体中的E2已经成为国内外研究的热点问题，很多学者对E2在环境中的分布、迁移和转化等问题开展了一系列研究，也分离和鉴定出一些能够降解E2的菌株，例如Fujisawa[11]分离出的E2降解菌Novosphingobiumsp.(ARI-1)等，但有关红球菌的E2降解特性以及对E2降解条件优化的研究尚未见报道.

本研究从北京一药厂曝气池的活性污泥中驯化、分离获得一株能以E2为唯一碳源和能源生长的细菌，经初步鉴定为红球菌(Rhodococcussp.)，对该菌株的E2降解特性、降解条件和降解产物进行了研究，初级降解产物为雌酮.该项研究将为天然雌激素类降解的生物处理提供新的菌株材料，为构建和强化E2降解工程菌提供理论依据和试验参数.

1 材料与方法

1.1 试剂

17 β-雌二醇(E2)为Sigma公司生产，色谱纯(纯度大于98%).其他药品均为分析纯.

1.2 样品来源与培养基

样品来自北京某生产避孕药工厂的曝气池泥样.

无碳源的无机盐液体培养基为：NaHPO44.26 g/L，KH2PO42.65 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，CaCl20.02 g/L.用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl调pH=7.0.加入1 mL的微量元素，用蒸馏水定容至1 000 mL.

图1 17β-雌二醇化学结构式

微量元素为：NiCl2·6H2O 0.024 g/L，CoCl2·6H20 0.19 g/L，H3BO30.006 g/L，ZnCl20.07 g/L，CuCl2·2H2O 0.002 g/L，MnSO4·H2O 0.061 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024 g/L.

LB培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，调pH=7.4.固体培养基为LB液体培养基中添加2%的琼脂.

碳源：17β-雌二醇，其化学结构式见图1.

1.3 E2降解菌的富集、筛选和纯化

将实验所用各种玻璃器皿用蒸馏水洗净备用.配制质量浓度为500 mg/L的E2母液，取1 mL母液加入到盛有100 mL无机盐液体培养基的三角瓶中，使无机盐液体培养基中E2的终浓度为5 mg/L.将三角瓶放入到恒温水浴箱中，60℃水浴30 min，使甲醇完全蒸发，高压灭菌.将泥样按1∶10的体积比加入到液体培养基中，并加入体积比1∶10的实际污水，在30℃，120 r/min的恒温振荡培养箱中培养72 h.从每瓶培养基中取200 μL菌液加入到新鲜培养基中，继续培养7 d.按此法将菌液接种到含有E2质量浓度为20，40，60，80，100 mg/L的新鲜无机盐液体培养基中培养(重复3次).

选择E2降解率最高的样品，取1 mL菌液用无菌水从10-2逐级稀释至10-8，在LB固体培养基上进行涂布，做3个平行组.培养3 d，观察菌落.用接种环挑取长势好的菌落在LB固体培养基上进行多次划线，直至分离出单个菌落.然后将单菌落接种到以E2为唯一碳源的无机盐液体培养基中进行复筛，用试管斜面将能降解E2的单菌落4℃保存.

1.4 菌种鉴定

1.4.1 形态学观察

利用光学显微镜和电子显微镜观察菌落的形态特征[12]，测定菌落的外形大小，并对细菌进行革兰氏染色.

1.4.2 生理生化指标

生理生化实验参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]和《伯杰细菌鉴定手册》[14].

1.4.3 菌株16S rDNA鉴定

参照《常见细菌鉴定手册》，用细菌的通用引物通过PCR扩增技术扩增DNA.

上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

下游引物1492R：5′-TACCTTGTTACGATT-3′.

测序结果利用NCBI中的blast工具与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较.并用软件MEGA构建系统发育树.

1.5 菌悬液的制备

将菌液在30℃，120 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h.用灭过菌的离心管4 000 r/min离心15 min，倒去上清液；加入pH=7的磷酸盐缓冲溶液洗涤，4 000 r/min再次离心15 min，倒去上清液.如此反复洗涤3次.用漩涡混合器将菌体打散，再用磷酸盐缓冲溶液将菌液稀释到D(600)的值为1.0，制成菌悬液备用.

1.6 E2降解菌特性研究

处理温度设定为4℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃；pH值设定为：4，5，6，7，8，9，10，11；E2质量浓度设定为：0.5，1，5，10，40，60，80，100，150，200 mg/L；菌种初始接种量为：1%，2%，3%，5%，7%，9%，12%.研究菌株生长特性和E2降解特性.每个影响因素设置3个平行组，以不接菌的培养基作为空白对照.将菌株在30℃，120 r/min恒温振荡培养箱中培养3 d，测定在不同影响因素下的E2降解率和D(600).选用五因素四水平正交表设计正交实验.

1.7 降解物及浊度分析与检测

将样品用乙醚等体积萃取，重复3次.萃取液用旋转蒸发器蒸干，甲醇定容.0.22 μm滤膜过滤后加入色谱瓶.用高效液相色谱仪(HPLC，Wasters1525)测定雌激素浓度，检测器为UV(DualλAbsorbance Detector，Water2487)，色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 mm).流动相体积比为V(乙腈)∶V(水)=1∶1，检测器波长为275 nm，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，每个样品重复检测3次，取平均值.样品的浊度用酶标仪在600 nm处检测，用吸光度(D(600))表示.

E2初级降解产物用高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS/MS)测定.高效液相色谱的测定条件如上所述；质谱测定条件：API2000质谱仪，ESI源，负离子扫描，蒸汽温度400℃，毛细管温度200℃，以不接菌株的样品作为对照.

2 结果

2.1 E2降解菌的分离

图2 菌株DS201电镜照片

样品富集驯化8周后，分离出20株能够以E2为唯一碳源和能源生长的细菌.用高效液相色谱仪测定20株细菌对E2的降解率，用酶标仪测定吸光度.综合E2降解率和浊度优选出1株最佳菌株，命名为DS201，将其作为后续研究菌种.

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株的形态特征和生理生化指标

菌株DS201在LB培养基上，菌落呈圆形，表面圆润，边缘完整，粉色，不透明，直径1.5～3.0 mm，革兰氏染色阳性.扫描电镜观察，菌株DS201的形态呈球形，无鞭毛(见图2).

菌株DS201的生理生化特性实验结果见表1.

2.2.2 16S rDNA鉴定

将菌株DS201的16S rDNA的基因序列输入到NCBI在线blast比对程序与GenBank基因库中的核酸数据进行同源性比对检索.比对结果表明，菌株DS201的16S rDNA基因序列与GenBank基因库中的红球菌属(Rhodococcus)中的多株红球菌和马红球菌的16S rDNA的基因序列有99%以上的同源性，结合菌株DS201的形态特征和生理生化指标，初步确定菌株为红球菌，命名为红球菌(Rhodococcussp.)DS201.选取红球菌属中的18个菌株的16S rDNA基因序列，并选取分枝杆菌属(Mycobacterium)中的2个菌株16S rDNA基因序列做外群，使用MEGA软件并根据Neighbor-Joining进行系统进化树分析，构建的无根系统发育树见图3.

图3 菌株DS201的系统发育树

2.3 DS201 E2降解特性

温度对菌株DS201降解E2的影响：菌株DS201随着温度的升高降解E2的能力明显提高.当温度到达30℃时，E2降解率达到最高.温度再升高，E2降解率逐渐下降.说明菌株DS201 E2降解最适温度为30℃(见图4a).

图4 菌株DS201降解E2特性

pH值对菌株DS201降解E2的影响：菌株DS201在pH=4时，降解率很低；在pH=6～8时，降解率较高；在pH=7时，降解率最高.说明菌株DS201的E2降解最适初始pH=7(见图4b).

底物浓度对菌株DS201降解E2的影响：当E2的质量浓度为0.5～5 mg/L时，降解率随着浓度增加逐渐升高；当E2的质量浓度为5～60 mg/L时，E2的降解出现一定程度的抑制；当E2的质量浓度为60～200 mg/L时，E2的降解虽然受到一定程度的抑制，但随着浓度的增加不再出现明显下降的情况.说明该菌株具有较强的抵抗生物毒性的能力.菌株DS201降解E2的最适底物质量浓度为5 mg/L，降解率达到89.1%；在质量浓度为200 mg/L时，降解率为39.2%(见图4c).

接种量对菌株DS201降解E2的影响：当菌株DS201的接种量在2%时，E2的降解率最高，随着接种量的增加，E2的降解率受到明显抑制.说明菌株DS201降解E2的最适接种量为2%(见图4d).

选择温度、pH、底物质量浓度和接种量进行正交实验.对正交实验数据进行极差分析，结果见表2.

表2 菌株DS201降解E2条件优化的极差分析

由表2的极差分析可知，温度对菌株DS201降解E2的影响最大，随着温度的变化平均降解率出现明显变化，30℃平均降解率最高.底物浓度对菌株DS201降解E2的影响次之，随着底物浓度的升高，平均降解率先升高再降低，底物质量浓度为1 mg/L的平均降解率最大.再次是pH对菌株DS201降解E2的影响，在偏酸和偏碱环境中E2的平均降解率都没有中性环境的降解率高.最后是接种量对菌株DS201降解E2的影响，随着接种量的增加，E2的平均降解率下降，这可能是营养物质的量限制了菌株E2的降解能力.

将正交实验数据使用软件SPSS(statistical product and service solutions)进行方差分析，P<0.05为差异显著，结果见表3.由表3可见，温度和底物质量浓度对DS201降解E2的影响特别显著，pH对DS201降解E2的影响非常显著，而接种量对DS201降解E2的影响显著.所以，因素主次顺序为：温度—底物质量浓度—pH—接种量.结合正交实验的极差分析和方差分析，以降解率为指标，菌株DS201降解E2的最优水平组合为温度(3)-底物浓度(2)-pH(3)-接种量(1)，即温度为30℃、底物质量浓度为1 mg/L、pH=7、接种量为1%时，降解率达到最高.

表3 菌株DS201降解E2条件优化的方差分析

aR2=0.996.

2.4 中间代谢产物测定

用HPLC-MS/MS检测菌株DS201降解E2的代谢产物，测得的实验结果见图5.

图5 菌株DS201降解E2中间产物的高效液相色谱-质谱联用分析结果

续图5

图5a的5号峰和图5b的5号峰为E2峰，保留时间为9.7 min.通过比较图5a与图5b，推测图5b的7号峰为中间代谢产物峰.对图5b的5号峰和7号峰进行质谱检测，结果见图5c和图5d.对比这两幅质谱图发现荷质比为269.1的物质可能为代谢产物，因此对其进行二级质谱检测，结果见图5e.由图5e可见，荷质比为269.1的物质是一个完整的物质，故确定其为E2的初级代谢产物.将该物质的相对分子质量为270输入NIST Chemistry WebBook 数据库，找到对应的物质，并结合E2化学键断键和成键规律，确定E2的初级代谢产物为雌酮(estrone，E1).

3 结论

从北京某生产避孕药工厂的曝气池活性污泥中驯化、分离得到20株能以17 β-雌二醇为唯一碳源生长的降解菌株，经过进一步筛选，得到了一株降解率高且稳定的降解菌DS201.经过对其进行形态学、生理生化指标以及16S rDNA序列分析，初步鉴定该菌株为红球菌(Rhodococcussp.).通过单因素实验得到了DS201最适的降解条件为：温度30℃、pH=7、最佳接种量为2%、底物浓度为5 mg/L.通过正交实验优化降解条件，结果表明，菌株DS201在温度30℃，pH=7，接种量1%，培养3 d能够完全降解底物质量浓度为1 mg/L的17 β-雌二醇.通过HPLC-MS/MS联用鉴定出17 β-雌二醇的初级代谢产物是雌酮.

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(责任编辑：方 林)

Isolation，identification of 17 β-estradiol-degradingRhodococcussp.strain DS201 and its degradation characteristics

YU Qing-miao1，2，WANG Ping3，LIU Dong-bo3，ZHAO Hong-yan3， SHAO Yuan-yuan1，MA Zhe1，HUO Hong-liang1

(1.School of Envionment，Northeast Normal University，Changchun 130117，China； 2.School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210023，China； 3.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

A novel bacterium capable of degrading 17 β-estradiol(E2) was isolated from the activated sludge collected from wastewater treatment plant of pharmacy factory mainly producing contraceptive medicine in Beijing.According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，this strain was identified asRhodococcussp. By tests in shaking flasks，the effects of the conditions of growth was studied，and it was determined that the optimum conditions of growth for the strain was 30℃，pH=7 and inoculum amount 2% and E2 initial concentration of 5 mg/L.The degrading conditions for strain DS201 was further optimized by tests in orthogonal tests.The results showed that the conditions for the degradation of E2 by strain DS201 were 30℃，initial pH=7，and inoculum amount 1%，this strain could degrade E2 completely within 3 d with intial concentration of 1 mg/L.Mass spectrum analysis demonstrated estrone that the main catabolic intermediates during E2 degradation.

17 β-estradiol；Rhodococcussp；biodegradation；estrogenic activities

1000-1832(2017)01-0140-08

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.01.026

2015-11-20

国家自然科学基金资助项目(51478096).

于清淼(1990—)，男，博士研究生；通讯作者：霍洪亮(1963—)，男，教授，主要从事污水处理与资源化研究.

X 799.3 [学科代码] 610·30

A