小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达

何亚鹏，鲍长磊，张 琪，付明哲，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达

何亚鹏，鲍长磊，张 琪，付明哲，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

根据GenBank已登录的PPRV基因组序列，设计并合成2对特异性引物，以PPRV疫苗株基因组为模板，经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析，再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中，经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达，并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因，重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7 ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1 ku的M蛋白(基质蛋白)，2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合，具有良好的反应原性。

小反刍兽疫毒；N基因；M基因；克隆；序列分析；原核表达

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits virus,PPRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，主要感染山羊、绵羊和鹿等小反刍动物，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须通报的动物传染病，中国将其列为一类动物疫病[1]。PPRV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员。PPRV的基因组为不分节段的单股负链RNA，从3′至5′依次是N-P-M-F-H-L6个基因，编码8种相应的蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、囊膜基质蛋白(M)、纤突糖蛋白(F)、血凝素蛋白(H)及2个非结构蛋白(C和V)[2-3]。N基因全长1 674 bp，包含1个开放性阅读框(ORF)，编码525个氨基酸，其编码的N蛋白在病毒蛋白中含量最高，同时也是核蛋白核心的主要组成元素，与RNA紧密结合，保护核酸，其被认为在病毒的复制和转录中起主要作用[4]。M基因全长1 466 bp，含1个ORF，编码335个氨基酸，M蛋白有形成病毒囊膜的内层，与病毒的成熟释放有关[5-6]。中国2007年暴发小反刍兽疫疫情[7]，造成严重的经济损失，近期中国境内又有小反刍兽疫的发生[8-9]。目前，针对小反刍兽疫尚无有效的治疗手段，主要靠疫苗进行防控。疫苗免疫后免疫效果如何？需要进行抗体水平的检测。因此，建立快速有效的抗体检测方法就显得尤为重要。本试验对小反刍兽疫的N和M基因进行克隆并原核表达，为下一步小反刍兽疫基因工程疫苗的开发、单克隆抗体的制备及抗体快速诊断方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒、菌种和质粒 PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1株)为新疆天康畜牧生物技术股份有限公司产品；pEASY-T1 Cloning Kit、感受态细胞Trans5a、原核表达菌株BL21为北京全式金生物技术有限公司产品；pET-28a质粒由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂 FastQuant RT Kit、Trizol Reagent为天根生化科技(北京)有限公司产品；2×EsTaqMasterMix、DM2000 DNA Marker、Super DNA Marker、广谱蛋白Marker购于北京康为世纪生物科技有限公司；Blue plus Ⅱ Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司；各种内切酶、T4DNA连接酶购于NEB公司；血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；IPTG购自Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 血清 PPRV阳性血清为采自临床免疫过PPRV弱毒疫苗(Nigeria 75 /1株)的羊血清。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中收录的PPRV全基因序列，并参考国内外相关文献[3-4,6]，利用Primer 5.0引物分析软件设计引物，用于扩增PPRV的N基因(N-F/N-R)和M基因(M-F/M-R)，N基因上游引物5′- CCGGAATTCGCTACTCTCCTTAAAAGCTTGGCAT -3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物5′- CCGCTCGAGGCTGAGGAGATCCTTGTCGT- TGTAG-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，目的片段为1 578 bp；M基因上游引物5′- CCGGGATCCACCGAGATCTACGATTTTGATAA- AT -3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)，下游引物5′- CCGCTCGAGCAGGATCTTGAACAGGCCTTGATCA -3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，目的片段为1 008 bp。引物由Invitrogen上海贸易有限公司合成，-20℃保存，备用。

1.2.2N和M基因的扩增与克隆 取PPRV疫苗株稀释液200 μL，用Trizol Reagent说明书方法提取RNA，以提取的基因组RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书将病毒RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增N和M基因。胶回收N、M目的基因片段，连接至pEASY-T1载体并转化克隆感受态细胞，PCR鉴定，提取阳性质粒并命名为pEASY-T1-N、pEASY-T1-M。

1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pEASY-T1-N及pET-28a空质粒；BamHⅠ 和XhoⅠ双酶切pEASY-T1-M及pET-28a空质粒；琼脂糖凝胶电泳并回收酶切产物。T4连接酶将回收的N和M目的片段与对应相同酶切的pET-28a线性化质粒于16 ℃连接过夜。将连接产物转化克隆感受态细胞Trans5α中。挑取单克隆后扩大培养，分别进行PCR和双酶切鉴定后送华大基因(北京)测序。

1.2.4 重组蛋白N和M的诱导表达及表达条件的优化 将鉴定为阳性的重组质粒pET28a-N和pET28a-M以及pET-28a空载体分别转化表达感受态细胞BL21，挑取单克隆，37 ℃、220 r/min 过夜培养，按φ=1%转接5 mL新鲜LB培养基，培养至对数期，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导培养，分别于诱导后3、4、5、6、7 h收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5 重组蛋白的Western blot分析 将重组蛋白表达产物进行常规SDS-PAGE后，250 mA恒流转膜2.5 h。以50 g/L脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h，分别以1∶500倍稀释的PPRV阳性血清4 ℃孵育PVDF膜过夜。TBST振荡洗涤3次，每次15 min。将PVDF膜以1∶5 000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG抗体室温孵育2 h，TBST振荡洗涤3次，每次15 min。ECL反应液孵育PVDF膜，暗室压片曝光。同时设立阴性对照。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1株)提取的RNA为模板，经RT-PCR扩增得到1 578 bp的N基因和1 008 bp的M基因，与预期大小相符(图1)。

M.DNA Marker DL2000；1.N基因扩增产物 Amplification ofNgene；2.M基因扩增产物 Amplification ofMgene

图1N和M基因的扩增
Fig.1 Amplification ofNandMgene by PCR

2.2 原核重组质粒的鉴定

重组质粒pET28a-N经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳后出现1 578 bp的目的条带和5 369 bp的载体条带。重组质粒pET28a-M经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳后出现1 008 bp的目的条带和5 369 bp的载体条带。同时双酶切pET-28a载体作阴性对照，载体条带与阴性对照大小相同，目的条带与PCR鉴定相符，说明重组质粒构建正确(图2)。

M.DNA Marker DL10000；1.pET-28a 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 pET-28a digested usingEcoRⅠandXhoⅠ；2.pET28a-N经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 pET28a-Ndigested usingEcoRⅠandXhoⅠ；3.N基因扩增产物 Amplification ofNgene；4.pET-28a 经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 pET-28a digested usingBamH ⅠandXhoⅠ；5.pET28a -M经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 pET28a-Mdigested usingBamH ⅠandXhoⅠ；6.M基因扩增产物 Amplification ofMgene

图2 重组表达质粒的双酶切鉴定
Fig.2 Digestion identifications of recombinant plasmid

2.3N和M基因的序列分析及编码氨基酸的结构预测

测序结果表明，该N和M序列与Nigeria 75/1的核苷酸序列100%符合，表明基因克隆正确。利用Internet在线软件预测N和M基因编码的氨基酸序列。结果表明，N和M氨基酸序列均没有信号肽和跨膜区。对N基因编码蛋白的亲水性分析表明，N基因编码的核衣壳蛋白在10～23、120～164、184～230、240～251、399～467、471～495和504～525位的氨基酸残基处有较高的亲水性；由抗原表位分析图可知，核衣壳蛋白在第10～21、44～70、83～101、106～114、119～127、132～147、182～230、239～252、318～328、340～361、366～377、398～415、421～466、471～494和503～525位可能存在抗原表位(图 3)。对M基因编码基质蛋白的亲水性分析表明，M基因编码的基质蛋白在4～13、23～32、42～49、59～69、82～97、149～158、163～181、196～215、221～243、258～271、286～300和312～321位的氨基酸残基处有较高的亲水性；由抗原表位分析图可知，基质蛋白在第5～32、35～49、59～71、79～96、149～157、161～170、195～204、209～216、222～244、261～271、286～292和311～322位可能存在抗原表位(图 4)。

2.4 重组蛋白诱导表达条件的优化

用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导不同时间(3～7 h)，SDS-PAGE凝胶电泳结果显示在诱导6 h后，重组蛋白N表达量显著增加，在7 h时表达量最大(图5)；诱导5 h后，重组蛋白M表达量显著增加，在6 h时表达量最大(图6)；pET-28a空质粒对照组和pET28a-N和pET28a-M未诱导对照组均没有重组蛋白的表达。

图3 N蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性分析Fig.3 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of N protein amino acid

图4 M蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性分析Fig.4 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of M protein amino acid

M.蛋白分子质量标准 Protein Marker；1.诱导pET-28a Induced cells containing pET-28a；2.未诱导pET28a-NUninduced cells containing pET28a-N；3～7.分别诱导3～7 h的pET28a-NCells containing pET28a-Ninduced for 3-7 h respectively

图5 不同诱导时间对N重组蛋白表达的影响
Fig.5 Effects of different induction time on expression of N fusion protein

M.蛋白分子质量标准 Protein Marker；1.诱导pET-28a Induced cells containing pET-28a；2.未诱导pET28a-MUninduced cells containing pET28a-M；3～7.分别诱导3～7 h的pET28a-MCells containing pET28a-Minduced for 3-7 h respectively

图6 不同诱导时间对M重组蛋白表达的影响
Fig.6 Effects of different induction time on expression of M fusion protein

2.5 重组蛋白的Western blot分析

Western blot结果显示(图 7)，N和M重组蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清发生特异性反应，出现特异性条带，而阴性对照转染空载体pET-28a的重组菌与阳性血清不反应。

M.蛋白分子质量标准 Blue plus Ⅱ Protein Marker；1.N重组蛋白 N fusion protein；2.M重组蛋白 M fusion protein；3.pET-28a对照菌 pET-28a control

图7 N和M重组蛋白的Western blot结果
Fig.7 Western blot analysis of N and M fusion protein

3 讨 论

本研究成功克隆PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1)的N和M全长基因，测序结果与NCBI中Nigeria 75 /1的核苷酸序列100%相符合，证明N和M基因克隆正确。利用在线生物软件预测N、M蛋白序列，分析表明N和M蛋白均没有信号肽序列和跨膜结构域；亲水性分析表明，N和M基因编码的蛋白均有较高的亲水性；由抗原表位分析表明，N和M基因编码的核心蛋白存在多个可能抗原表位。综合分析表明，N基因编码的核衣壳蛋白和M基因编码的基质蛋白均具有较强的抗原性和亲水性，且抗原性峰值和亲水性峰值基本同步。N和M基因编码的蛋白具有良好的抗原性，成为临床上诊断PPRV感染的理想抗原，必将在PPRV的诊断及血清学调查中发挥巨大作用。

大肠埃希菌表达系统具有方便、高效、简单、可操作性强等优点。pET-28a(+) 为高效表达载体，pET-28 a(+)中的His标签蛋白在纯化过程中起到很重要的作用，为今后的蛋白纯化提供保障[4]。本试验将N和M基因克隆于pET-28a原核表达载体T7启动子的下游，与His-tag同框融合，构建原核表达载体，并在宿主菌BL21中成功诱导表达N和M蛋白。在诱导表达的过程中，通过对诱导剂的浓度、诱导温度、诱导时间的调节，最终确定诱导表达的最佳条件为37 ℃，IPTG的终浓度为 1 mmol /L、220 r/min、诱导7 h获得PPRV N抗原蛋白；37 ℃、IPTG的终浓度为1 mmol /L、220 r/min、诱导6 h获得PPRV M抗原蛋白。Western blot检测N和M蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合，出现特异性条带，说明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。本试验为建立实验室快速诊断PPRV 的感染、疫苗免疫后抗体水平的检测以及基因工程疫苗的研制奠定基础。

小反刍兽疫近年在中国周边国家包括孟加拉国、印度、尼泊尔、巴基斯坦、哈萨克斯坦和蒙古等先后暴发大规模PPR疫情[10-12]，中国也在2007年报道西藏地区发生小反当兽疫疫情，给畜牧业生产带来巨大的经济损失[7]，其大规模爆发的风险明显提高，且近期境内罕见发生的PPR疫情[9]，农业部也积极防控，所以当前应加强对PPRV的基础研究，同时还应加强对该病的流行病学监测，建立高效、快速、可靠的病原学检测新方法，并研发出可引起强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答的疫苗，以有效控制该病在中国的流行，甚至消灭该病。国际上针对小反刍兽疫的诊断技术主要有琼脂免疫扩散试验(AGID)、病毒分离鉴定、胶体金试纸条、竞争ELISA、夹心EIISA、RT-PCR、中和试验等[8]。而特异性高、操作简便、成本低对病毒的检测很重要。ELISA方法更加方便、快捷、可靠，适用于大量样品的检测诊断。N蛋白的抗原稳定性高，而基因的保守与特异性是建立ELISA方法的关键，而M蛋白含有众多B细胞线性表位。所以本试验对GenBank发表的PPRV Nigeria 75/1株N和M基因序列进行克隆、分析及原核表达，旨在为以后建立抗体间接ELISA的快速诊断方法奠定物质基础。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression ofNandMGene of Peste des Petits Ruminants Virus Vaccine Strain

HE Yapeng,BAO Changlei,ZHANG Qi,FU Mingzhe and XU Xingang

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

According to the published sequence ofNandMgene of PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain，two pairs of specific primers were designed and synthesized.NandMgene were amplified by RT- PCR from PPRV.NandMgene sequences were analyzed and cloned into pET-28a vector.The recombinational prokaryotic expression plasmid pET28a-Nand pET28a-Mwere successfully constructed.E.coliBL21 transformed by recombinant plasmid pET28a-Nand pET28a-Mwere induced by IPTG and detected by SDS-PACE and Western blot analysis.NandMgene were successfully cloned and expressed.SDS-PAGE analysis showed that 57.7 ku N and 38.1 ku M fusion protein were expressed by IPTG induction,respectively.Western blot analysis showed that the N and M fusion protein could combine with PPR positive serum and had well reactiongenicity.This experiment provides molecular biology characteristics of PPRV.Further more,the N and M protein can be used to prepare PPRV antibody detection kit.

PPRV;Ngene;Mgene; Clone; Sequence analysis; Prokaryotic expression

HE Yapeng,male,master student.Research area:molecular etiology and immunology.E-mail:1692831800@qq.com

XU Xingang,male,Ph.D,associate professor.Research area:molecular etiology and immunology.E-mail: 286567031@qq.com

日期：2016-12-29

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.008.html

2015-12-21

2015-12-29

陕西省科技攻关(2015NY162)；西北农林科技大学试验示范站(基地)科技成果推广(TGZX2015-32)；陕西省科技统筹创新工程计划(2016KTZDNY02-05)。

何亚鹏，男，硕士研究生，研究方向为分子病原学与免疫学。E-mail：1692831800@qq.com

许信刚，男，博士，副教授，研究方向为分子病原学与免疫学。E-mail：286567031@qq.com 付明哲，男，高级兽医师，研究方向为羊病学。E-mail：1692831800@qq.com

S852.61

A

1004-1389(2017)02-0179-06

Received 2015-12-21 Returned 2015-12-29

Foundation item Shaanxi Province Science and Technology Research Project(No.2015NY162);Northwest A&F University Scientific and Technological Generalized Project of Test Station(No.TGZX2015-32)；Shaanxi Province Science and Technology Co-ordination Innovation Project(2016KTZDNY02-05).

FU Mingzhe,male,senior veterinarian.Research area:sheep disease.E-mail:1692831800@qq.com