334份青藏高原野生大麦群体结构及连锁不平衡水平分析

宋远方，夏腾飞，徐金青，王寒冬，沈裕虎，3，王 蕾，3

(1.中国科学院 高原生物适应与进化重点实验室，西北高原生物研究所，西宁 810001；2.中国科学院大学，北京 100039；3.青海省作物育种重点实验室，西宁 810001)

334份青藏高原野生大麦群体结构及连锁不平衡水平分析

宋远方1,2，夏腾飞1,2，徐金青1,2，王寒冬1，沈裕虎1，3，王 蕾1，3

(1.中国科学院 高原生物适应与进化重点实验室，西北高原生物研究所，西宁 810001；2.中国科学院大学，北京 100039；3.青海省作物育种重点实验室，西宁 810001)

利用1 389个DArT标记对334份青藏高原西藏野生大麦材料进行遗传多样性、群体结构和连锁不平衡水平分析。结果显示，参试群体DArT标记的多态性信息含量(PIC)值为0.005 6～0.500 0，平均值为0.248 9。运用贝叶斯、主坐标分析2种方法对野生大麦的群体结构进行研究。结果显示参试材料存在明显的群体分层，各个亚群中的个体不同来源、不同棱形、不同皮裸性混杂分布。以标记位点间的相关系数平方(r2)作为衡量连锁不平衡(LD)水平的参数，在整体上，LD水平随着遗传距离的增加递减，各个染色体内也有相同的趋势，不同染色体的LD水平不同。以r2=0.2为阈值统计，大于0.2的位点组合中，P<0.001的位点组合比例为3.31%，r2的平均值为0.454；群体的LD衰减距离为0.3 cM，衰减较快。青藏高原地区野生大麦群体结构和连锁不平衡水平的研究为杂交育种和关联图谱的构建奠定了良好的基础。

大麦；DArT标记；群体结构；连锁不平衡

大麦栽培历史悠久，是世界上第四大粮食作物[1]。大麦是农艺学上重要的大基因组作物，具有大量的品种，在世界范围内广泛分布[2]。中国大麦遗传资源丰富，但其遗传多样性在地区间有很大的差异[3]。野生二棱皮大麦(Hordeumspontaneum)是现在栽培大麦的祖先，在新石器时期就被驯化作为一种粮食作物[4]。青藏高原及其边缘地区被认为是栽培大麦的驯化中心之一[5]，该地区有丰富的野生大麦资源分布。该地区野生大麦无分布群落，主要与农作物混生，不同变种呈现重叠分布，穗和籽粒的深色型比例大，尤以黑壳类型丰富而广布[6]。分类上，主要为野生二棱大麦(Hordeumspontaneum)、野生六棱大麦(Hordeumagtiocrithon)2个亚种，分别有12个和36个变种，其中野生二棱退化型和裸粒型是世界罕见的珍贵遗传资源[6]，是青藏高原地区青稞育种研究中可利用的重要种质资源。

近年来，国内外研究者对1 a生野生大麦开展了农艺性状与品质性状分析[7-8]、遗传多态性分析[9-12]和多种非生物胁迫抗性如干旱[13]、酸铝[14]和盐害[15]等性状的鉴定和优异种质的发掘，这些研究表明青藏高原野生大麦具有丰富的遗传多样性和遗传变异。Dai等[5]研究表明，近东地区的野生大麦遗传多样性高于青藏高原野生大麦，参试野生大麦材料分为4个亚群，青藏高原野生大麦和近东地区野生大麦分在不同的亚群。Wu等[16]对188份青藏高原野生大麦的群体结构和LD水平研究发现参试野生大麦群体分为8个亚群。但是Wang等[12]对90份野生大麦(青藏高原野生大麦45份，中东地区野生大麦45份)的遗传多样性研究表明，青藏高原地区野生大麦的遗传多样性高于中东地区野生大麦，聚类分析结果表明青藏高原野生大麦和中东地区野生大麦分在两个亚群中。Khodayari等[17]利用22个微卫星标记对来自于伊朗的94份野生大麦进行遗传多样性研究，结果表明野生大麦具有较高的遗传多态性。Zhang等[18]利用49对SSR引物对240份国内和60份国外大麦材料的遗传多样性进行研究，发现国内外材料遗传基础组成差异较大。Ivandic等[19]利用33 个SSR标记对以色列、土耳其和伊朗的39 份野生大麦基因型的遗传多样性研究表明，大多数材料能按国家归类。Cai等[20]研究表明西藏野生大麦遗传多样性丰富，基因组LD水平栽培大麦高于野生大麦。Russell等[21]研究表明“新月沃地”地区的野生大麦与地方品种大麦相比具有较高的遗传多样性，大麦地方品种与野生大麦相比具有较高的LD水平。

种质资源是育种的物质基础，对其进行准确分析和评价是合理利用资源的前提[22]，充分了解自己所拥有的育种材料的遗传变异程度是十分必要。本研究利用1 389个DArT标记对334份青藏高原野生大麦的遗传多样性、群体结构及连锁不平衡水平进行系统研究分析，旨在拓宽亲本资源，为野生大麦在育种中的利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

参试材料为334份野生大麦材料，分别来自西藏、青海、四川3省区，包括野生二棱皮大麦95份，野生二棱裸大麦59份，野生六棱皮大麦125份，野生六棱裸大麦55份(图1)。所有参试材料由国家作物种质库青海复份库提供。

图1 334份参试材料地理分布Fig.1 Geographical distribution of 334 accessions

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 每个大麦材料取5粒种子种于培养皿中，2周后取新鲜叶片采用改进的CTAB法(Stewart Jr&Via,1993)进行基因组DNA的提取。

1.2.2 DArT标记基因组扫描 基因组DNA质量浓度调至约100 mg/L，每个材料取20 μL送交澳大利亚Diversity Arrays Technology Pty Ltd.公司进行全基因组DArT标记扫描(http://www.triticarte.com.au)。芯片型号为Barley PstI(BstNI)(1.7)。通过3次独立试验进行验证其基因分型质量。

1.3 数据分析

每个DArT标记的多态性信息含量(Polymorphism information content,PIC)按照下列公式计算：PIC=1-∑(pi)2。式中，pi为i个等位基因在群体中出现的频率[23]，该参数使用POWERMARKER 3.25软件进行计算[24]。

群体结构的分析采用2种方法。首先，利用Pritchard等[25]提出的贝叶斯模型的方法，使用STRUCTURE 2.2软件进行群体结构的划分。具体过程为，设定群体数(K)为1～16,并假定位点都是独立的。将MCMC(Markov Chain Monte Carlo)的不作数迭代(Length of burn-in period)设为100 000次，再将不作数迭代后的MCMC设为1 000 000次。每个K值进行10次运算，进行3次重复运算。每次运算软件产生1个Q矩阵，得到相应材料的Q值(第i材料其基因组变异源于第K群体的概率)。利用CLUMM软件[26]将10次运算的Q矩阵结果进行整合。其次，利用NTSYS 2.1软件进行主坐标分析。运算中用基于Nei氏距离的遗传相似性矩阵。

群体连锁不平衡(LD)水平的分析，以标记位点间的相关系数平方(r2)，作为衡量连锁不平衡的参数[27]。用2种形象化的方式来表示：LD衰减图和LD矩阵。LD衰减图是以连锁不平衡参数r2和标记位点间的遗传距离作散点图，表示一个区域内的LD分布情况；LD矩阵是某基因组内或染色体上多态性位点间的LD线性排列。以r2= 0.2作为阈值检测LD衰减。LD的计算在TASSEL软件中实现。

2 结果与分析

2.1 参试野生大麦的遗传多样性分析

通过3次独立重复控制DArT标记基因分型的质量，结果显示重复性为95.8%～100%，其中重复率在99%以上的标记占80%，说明基因分型结果重现性良好。 用2 304个DArT标记进行参试材料的全基因组扫描，最终有1 389个标记在参试群体中表现出多态性，其中有染色体位置信息的标记共698个，覆盖基因组长度为1 136.060 0 cM(表1)。

DArT标记为显性标记，所以其PIC值为0～0.5。参试野生大麦群体中，所用DArT标记的PIC值变异为0.005 6～0.500 0，平均值为0.248 9。不同染色体DArT标记PIC平均值变化较大，其中6H染色体PIC平均值最高，为0.291 2；4H染色体PIC平均值最低，为0.186 2(表1)。

2.2 参试野生大麦群体结构分析

运用贝叶斯模型和主坐标分析方法，对334份青藏高原野生大麦材料进行群体结构估测。贝叶斯方法结果显示，每次重复的LnP(D)值呈持续增大且无明显的拐点出现，无法直接确定合理的K值(图2-a)。对Q矩阵进行重复性检测，K=2或K=5时各重复间相关系数r>0.99(P<0.01)，因此，可以初步确定K的合理取值应该是2或者5；ΔK的计算结果表明，K=2或者K=5时，ΔK达到峰值(图2-b)。K=2时，如果将参试野生大麦材料分为2个亚群(WPOP1、WPOP2)，有243份材料的Q值≥0.8，占参试材料的72.75%，2个亚群中不同地理来源、不同棱型和不同皮裸性的材料混杂分布(表2)。当K=5时，情况亦然。

表1 全基因组和不同染色体上DArT标记分布及其PIC值Table 1 Distribution of DArTs on genome and different chromosomes and the mean of PIC

用1 251个多态性标记进行基于Nei氏距离的主坐标分析(去掉缺失大于10%的标记)，结果表明前3个主成分可累计解释31.71%的分子变异(分别为12.08%、11.81%、7.82%)。利用每个材料在3个主坐标中对应的特征向量做三维散点图(图3)，直观反映出群体材料间的聚类关系。将在贝叶斯方法中Q值<0.8的材料记为Admixed个体，图3-a和图3-b中的颜色标定同贝叶斯方法中不同亚群中Q值≥0.8的材料颜色一致。结果显示，主坐标分析与贝叶斯方法结果基本一致，不同棱型、不同皮裸性和不同地理来源的野生大麦混杂分布(图3-c)，这同青藏高原野生大麦混居的地理分布特征一致。

2.3 参试野生大麦基因组连锁不平衡分析

用554个已知染色体位置信息的多态性DArT标记进行参试材料群体基因组连锁不平衡分析(去除缺失大于20%和MAF小于5%的标记)。以标记位点间的相关系数平方(r2)作为衡量连锁不平衡性的参数。结果显示，参试材料群体基因组内存在一定程度的连锁不平衡性，统计概率(P<0.001)支持的LD成对位点占所有位点组合的比例为8.100%，其r2平均值为0.082，整体LD水平较低。由于4H染色体上可用的DArT标记仅有37个且分布不均匀，在下面不作分析。不同染色体上得到统计概率支持的(P<0.001)的成对位点数比例不同，其中2H上得到统计概率支持的成对位点数比例最大为13.690%，5H最小，为6.290%。5H成对位点的r2平均值最大(0.215)，1H成对位点的r2平均值最小(0.093)。 一般情况下，以r2=0.2阈值，认为r2高于该阈值时，连锁不平衡是由遗传连锁造成的[26]。以r2=0.2为阈值，整体上r2≥0.2的LD成对位点数占得到统计概率支持成对位点数的3.310%，r2平均值为0.454。不同染色体r2≥0.2的LD成对位点数比例和其r2平均值也不尽相同，5H上r2≥0.2的LD成对位点数的比例最高为18.520%，其r2平均值也最大(0.805),1H上r2≥0.2的LD成对位点数的比例最低为5.240%，但是r2平均值最小的染色体是2H。同一染色体内的r2≥0.2的LD成对位点数(9.640%)和r2平均值(0.552)均大于不同染色体间的数值，说明参试材料群体基因组内处于LD的成对位点主要来自于染色体内部而非不同染色体间。从整体上看，参试群体基因组LD随着标记间遗传距离的增大而减弱。如果将整个基因组或不同染色体划分为5个区段，可以发现，随着遗传距离增大，LD成对位点的r2平均值急剧减小，且这种变化主要集中在3 cM位置附近。从不同染色体来看，遗传距离≤3 cM时，5H上的LD成对位点r2平均值最大，1H上的LD成对位点r2平均值最小(图4-a)。

a.LnP(D) 值重复性检测The repeatability test of LnP(D)；b.ΔK值的变化The variance of ΔK；c,d.K=2或K=5时参试材料群体结构The population structure of accessions whenK=2 orK=5

图2 参试材料群体结构估测
Fig.2 The estimate of population structure for accessions

表2 各个亚群中参试野生大麦材料的分布情况Table 2 Distribution of different wild type barley in subpopulations

图3 参试野生大麦材料基于Nei氏距离的主坐标分析Fig.3 Principal coordinate analysis of wild barley accessions based on a Nei’s distance matrix

LD衰减所延伸的距离决定着关联分析所需使用的标记多寡及关联分析的精度。对DArT成对位点r2值对遗传距离(cM)进行回归分析发现(图4-b)，参试野生大麦群体DArT成对位点r2值随着遗传距离衰减迅速衰减且遵循方程：y=aln(x)+b。当r2=0.2时，整个基因组LD衰减距离仅为0.3 cM。不同染色体LD衰减水平差异很大，7H上LD衰减距离仅为0.035 cM，而5H LD衰减距离最大达到5.8 cM，说明每条染色体承受不同的选择压(表3)。

3 讨 论

3.1 参试野生大麦遗传多样性分析

Dai等[5]利用DArT标记的研究结果表明，近东地区野生大麦的遗传多样性(PIC=0.379)要高于青藏高原野生大麦(PIC=0.353)，也高于本研究参试野生大麦的遗传多样性水平(PIC=0.248 9)。其原因可能是近东地区的野生大麦群体分布远离大麦等作物种植区，其多样性能得以较为完整保留。而青藏高原地区的野生大麦是以野草形式在田间地头与栽培大麦等作物共生，且不同棱型、不同皮裸性的野生大麦交错分布，野生大麦与栽培大麦或不同类型群体间存在基因渗透，造成野生大麦多样性降低。同时，青藏高原环境严酷，对野生大麦群体适应性可能会产生某种定向自然选择过程，从而降低青藏高原野生大麦的遗传多样性。尽管如此，研究结果表明，青藏高原野生大麦的遗传多样性(PIC=0.248 9)依然高于农家品种(PIC=0.212 5)和育成品种(PIC=0.245 8)[28-29]，表明驯化家养过程中，为了适应复杂的地理环境和人类需求，野生大麦经历了严苛的自然选择和人工选择，基因组内有若干基因位点因其等位基因丢失而导致该位点多样性丧失，导致遗传多样性降低。

图4 参试野生大麦群体基因组及不同染色体的LD衰减Fig.4 LD decay as calculated across genome and different chromosomes of wild barley accessions

项目Item基因组Genome染色体内Intra-chr染色体间Inter-chr1H2H3H4H5H6H7HP<0.001标记对比例/%Percentageofpairsinsig.P<0.0018.10010.6407.63012.72013.69013.4508.3306.2907.7508.990P<0.001标记对r2平均值Averager2ofpairsinsig.0.0820.1210.0720.0930.1060.1200.2230.2150.1200.123r2>0.2标记对比例/%PercentageofpairsinLDr2>0.23.3109.6401.6805.2408.14010.59028.00018.52012.2209.110r2>0.2标记对r2平均值Averager2ofpairsinLD0.4540.5520.3080.4790.4620.4560.6610.8050.4630.636LD衰减距离LDextentdistance0.300--0.5100.3700.140-5.8000.0410.035

3.2 参试野生大麦群体结构分析

用贝叶斯和主坐标分析2种方法对334份青藏高原野生大麦进行群体结构估测，结果表明，参试青藏高原野生大麦内存在一定的群体结构。贝叶斯方法分析的结果显示，参试群体可划分为2个或5个亚群，当Q值>0.8时(Q值<0.8的材料记为Admixed个体)，主坐标分析结果同贝叶斯方法分析结果基本一致。从参试材料在各个亚群的分布来看，不同棱型、不同皮裸性和不同地理来源的材料混杂分布，且admixed个体数较多，各个亚群间没有明显的界限。推测其原因，一是这种群体结构样式同青藏高原野生大麦地理分布特征相符合。除了野生二棱皮大麦外，青藏高原还分布有大量的野生二棱裸大麦、野生六棱皮大麦和野生六棱裸大麦，这些野生大麦同栽培六棱裸大麦一起混杂分布于田间地头，没有地理隔离和生殖隔离条件下，各类型材料间很可能存在基因渗透现象；另一方面，可能是由于不同棱型、皮裸性或者地理来源的材料起源较为单一，起源地狭窄导致了参试群体结构样式。与本研究不同的是，邱龙[30]利用DArT标记采用STRUCTURE软件和聚类分析方法分析188份青藏高原1 a生野生大麦资源的群体结构，结果表明供试野生大麦基于棱型等可划分为8个亚群，其中2个亚群主要为野生六棱大麦，其他6个亚群多为野生二棱大麦。这可能是由于2个研究所用的材料类型和数目以及标记数目不尽相同造成的，还需要进一步的研究确认。

3.3 参试野生大麦群体连锁不平衡分析

对于野生大麦群体基因组LD水平的研究较少。邱龙[30]的研究发现青藏高原野生大麦群体LD衰减延伸距离为20 cM(r2=0.1)。这与Stracke等[31]和Kraakman等[32]的研究结果基本一致。同时，邱龙[30]的研究结果表明，青藏高原1 a生野生大麦的第2、6和7号染色体的LD衰减较快，其衰减的距离分别12.5、10和15 cM。与此不同的是，Morrell等[33]研究25份野生大麦群体的LD水平，Caldwell等[34]研究4个候选基因区段在3个不同大麦群体(野生大麦、农家品种、育成品种)中的LD水平。结果表明育成品种基因组LD衰减距离为212 kb，而野生大麦和农家品种这2个比较原始的群体中LD衰减明显要快于育成品种。Wang等[28]利用DArT标记研究发现，青藏高原大麦农家品种群体基因组LD衰减距离可达5.58 cM，育成品种群体基因组衰减距离为200.33 cM[29 ]。本项研究的结果同Morrell等[33]和Caldwell等[34]的一致，参试青藏高原野生大麦群体基因组LD衰减较快，其衰减距离为0.30 cM。6H和7H染色体LD衰减最快，5H衰减最慢。野生大麦作为原始群体，不同于农家品种和育成品种，由于未受到严苛的人工选择，发生在其基因组内的选择和重组事件较少，保留了较高的多样性水平，同时其基因组LD衰减距离较快。5H的LD衰减距离显著大于其他染色体(表3)，说明该条染色体上承受了较大的选择压，作为野生群体，这种选择压主要来自于群体适应于不同环境所产生的自然选择，推测在该条染色体上可能存在同环境适应性相关的基因。

利用DArT标记对334个青藏高原野生大麦群体进行群体结构和基因组LD水平估测，发现青藏高原野生大麦具有较高的遗传多样性水平，其群体结构同其混居的地理分布特征相适应，基因组LD衰减较快。野生大麦尽管具有碎穗、穗粒数少、千粒质量低等不利农艺性状，但抗逆、耐瘠，同时蛋白质含量等品质性状优良，在大麦育种中有着巨大的潜在应用价值。作为中国所独有的珍贵自然资源，对青藏高原野生大麦群体结构和基因组LD水平进行估测，有助于后续开展基于自然群体的关联作图和基因发掘工作，有利于拓宽目前大麦育种的遗传基础。

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(责任编辑：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Population Structure and Linkage Disequilibrium in 334 Wild Barley from the Qinghai-Tibetan Plateau

SONG Yuanfang1,2,XIA Tengfei1,2,XU Jinqing1,2,WANG Handong1,SHEN Yuhu1,3and WANG Lei1,3

(1.Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota,Northwest Plateau Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039,China；3.Key Laboratory of Crop Molecular Breeding of Qinghai Province,Xining 810001,China)

The genetic diversity,population structure,and extent of linkage disequilibrium (LD) were investigated at a genome-wide level in 334 wild barley (HordeumvulgareL.ssp.vulgare) from the Qinghai-Tibetan Plateau using 1 389 polymorphic diversity array technol-ogy (DArT) markers.The mean polymorphism information content (PIC) of the DArT markers ranged between 0.005 6 and 0.500 0 with an average of 0.248 9.Bayesian supported that all wild barley accessions from this region are divided into two distinct subpopulations; the individuals of each subpopulation are mixed distribution with different form and different skin naked.The LD values,expressed asr2,statistical threshold forr2=0.2,there are 3.31% of marker pairs (P<0.001) whenr2> 0.2,the average ofr2were 0.454; the LD levels in different chromosomes which of the same accessions are also different.The LD values declined with increasing genetic distance,and the same tendency occurred on each chromosome.The attenuation distance of the population is 0.3 cM,decaying rapidly.Our results discerned relevant patterns of genetic diversity,population structure,and LD among members of a Qinghai-Tibet Plateau wild barley accessions have important implications for further practical breeding and studies on association mapping.

Barley; DArT markers; Population structure; Linkage disequilibrium

SONG Yuanfang,male,master student.Research area:crop genetics and breeding.E-mail：songyuanfang20@163.com

WANG Lei,female,Ph.D,assistant researcher.Research area:crop genetics and breeding.E-mail：wanglei@nwipb.cas.cn

日期：2016-12-29

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.014.html

2016-01-14

2016-03-10

青海省应用基础研究计划项目( 2013-Z-724)；2013年度中国科学院“西部之光”人才培养计划“联合学者”项目； 青海省应用基础研究计划项目(2015-ZJ-702)；2015年度中国科学院“西部之光”人才培养计划“西部博士”项目；青海省自然科学基金(2015-ZJ-915)。

宋远方，男，硕士研究生，从事作物遗传育种方面的研究。E-mail：songyuanfang20@163.com

王 蕾，女，博士，助理研究员，从事作物遗传育种方面的研究。E-mail：wanglei@nwipb.cas.cn

Q347

A

1004-1389(2017)02-0201-09

Received 2016-01-14 Returned 2016-03-10

Foundation item The Applied Basic Research Project in Qinghai Province (No.2013-Z-724);the West Light Foundation of Chinese Academy of Sciences in 2013; the Applied Basic Research Project in Qinghai Province(No.2015-ZJ-702);the West Light Foundation of Chinese Academy of Sciences in 2015;Natural Science Foundation of Qinghai Province(No.2015-ZJ-915).