肺炎支原体渗透压诱导蛋白C的分子生物克隆及生物活性分析

黄浴日 向凯乐 饶立荣

邵阳学院 湖南省邵阳市 422000

肺炎支原体渗透压诱导蛋白C的分子生物克隆及生物活性分析

黄浴日 向凯乐 饶立荣

邵阳学院 湖南省邵阳市 422000

目的：用生物克隆的方法表达肺炎支原体（Mycoplasmsa pneamoniae, Mp）渗透压诱导蛋白C（Osmotically inducible protein C, OsmC）并测定其生物活性活性。方法：根据Mp的OsmC基因序列设计特定引物，PCR扩增OsmC基因。通过构建重组质粒pET28a-MpOsmC，并转化入大肠埃希菌BL21（DE3），来诱导目的蛋白表达。我们采用镍柱亲和层析法对OsmC蛋白进行纯化，再用氧化铁二甲酚橙试剂（FOX）测定OsmC蛋白的活性。结果：我们用生物克隆的方法得到Mp的OsmC基因片段，并成功构建重组质粒pET28a-MpOsmC。重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)后经过表达我们得到重组Mp OsmC蛋白，再经亲和层析得到高纯度的目的蛋白，且具有分解H2O2的活性。结论：重组Mp OsmC蛋白具有过氧化物酶的活性，为研究肺炎支原体的抗氧化机制提供了理论依据。

肺炎支原体；渗透压诱导蛋白C；分子克隆；分子活性

支原体是自然界中存在的最小的原核生物。这些无壁的，可塑的生物可以通过细胞过滤器，并在体外在无细胞条件下生长和繁殖。肺炎支原体（Mycoplasmsa pneamoniae, Mp）是被检出最多的支原体，除了引起非典型肺炎和社区获得性肺炎等主要呼吸道症状外，肺炎支原体还可能引起血液，心血管系统，胃肠道和皮肤中的自身免疫性溶血性贫血和其他疾病，并可诱发心包炎，心肌炎，肾炎和脑膜炎。肺炎支原体的致病作用与其产生超氧自由基有关，超氧自由基可以抑制宿主细胞过氧化氢酶，从而增加自由基损伤的作用。现有研究表明肺炎支原体表达的渗透压诱导蛋 白 C（Osmotically inducible protein C, OsmC）被认为有抗氧化的作用，可以缓解自由基带来的损伤作用。本研究通过克隆并纯化得到OsmC重组蛋白，并证明OsmC的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

Mp标准株M129(ATCC 29342)由南华大学病原生物学研究所保存；大肠杆菌BL21(DE3) 和 Top10; 表达质粒pET28a由邵阳学院医学检验学院保存。

1.1.2 试剂与材料

细菌DNA提取试剂盒、Taq酶、Reaction Buffer、dNTP、 蛋 白 Marker、DNA Marker、质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、T4连接酶购自Takara公司；限制性内切酶EcoR I、XhoI由本实验室提供； Ni2+亲和层析柱购买自美国GE公司；IPTG，卡那霉素，SDS，丙烯酰胺等化学试剂购自上海生工生物公司；蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxiod公司。

1.2 方法

1.2.1 Mp OsmC基因的信息学分析

用 Blast软件筛选Mp OsmC基 因(accession number: WP_012697836) 的 编码序列，利用Clustal软件将Mp OsmC蛋 白 与 大 肠 杆 菌 (E.coli， accession number WP_000152320)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，accession number:GAA46570.1）、 生 殖 支 原 体（Mycoplasma Genitalium，accession number: WP _009885605）) 和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，At，accession number: WP_010971192.1) 的OsmC蛋白序列进行同源性分析。

1.2.2 OsmC基因的扩增

根 据 软 件 primer 5.0设计 OsmC 的 上 游 引 物 FP : 5'AACATATGAAGGCAAGGCTCAAGCA 3'，下游引物RP：5'CCAAGCTTTCATTC CACTTCAATCAGGCTGA 3'，由华大基因合成；培养Mp，提取Mp基因组DNA，以此为模板PCR扩增OsmC基因。PCR反应条件：95℃ 5min; 94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min,共35个循环；72℃ 7min。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。

1.2.3 构建pET28a-MpOsmC载体

分别用EcoR I、XhoI内切酶将OsmC基因和pET28a进行双酶切，再用T4连接酶在16℃时将剪切片段进行连接，再用转染的方法将连接好的片段转进大肠杆菌Top10。

1.2.4 过氧化物还原酶的表达与纯化

将质粒pET28a-MpOsmC转化大肠埃希菌BL21(DE3)，经过培养后挑取单个菌落接种于LB培养基，恒温摇床上培养过夜。然后按照 1: 100 的体积比接种到新鲜LB液体培养基上培养至A600值约 等于0.8，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，32℃诱导目的蛋白表达，培养6 h收集菌体， 然后用PBS溶液洗涤并重悬菌体，冰浴超声破碎细菌，12 000 r/min离心 20 min，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤上清液，然后过Ni2+亲和层析柱，用洗涤缓冲液(50mmol/ L NaH2PO4，0.1mol/L NaCl，50mmol/L咪唑，PH 8.0) 洗脱非特异结合蛋白，用300 mmol / L咪唑洗脱并收集 Osm C蛋白，将OsmC蛋白透析，浓缩， SDS-PAGE检测纯化结果， Bradford法测定 Osm C蛋白的含量。

1.2.5 OsmC蛋白酶活性分析

利用氧化铁二甲酚橙试剂(FOX) 法测定OsmC蛋白的过氧化物酶活性。将0.25mg/m L、0.50mg/mL OsmC蛋白与5 mmol/L DTT于冰上孵育 1h，然后加入反应试剂(1 mmol/L DTT和 500 μmol/L H2O)，以没有加 OsmC蛋白的 PBS溶液为对照，间隔5 min取 100μL反应产物到空试管，立即加入20μL 0.25mol/L H2SO4终止反应，收集完所有样品后，以50μmol/ L～500μmol/L H2O2为标准曲线，在每个试管中加入880μL新配置的FOX试剂，反应 20min，测定 560nm处的吸光值，计算每管剩余的H2O2的量。实验重复 3次，取平准值作图。

2 结果

2.1 Mp OsmC蛋白序列结果

经过序列对比及测序我们发现Mp基因组含有一个编码OsmC的基因Mpn625。

2.2 重组质粒pET28a-MpOsmC的构建

PCR扩增Mpn625基因，经双酶切反应及T4连接酶连接后得到重组质粒pET28a-MpOsmC，经PCR验证，送阳性克隆测序验证正确。

2.3 目的蛋白的表达与纯化

将重组质粒转化入大肠杆菌，利用IPTG诱导OsmC蛋白的表达。通过Ni2+亲和层析法纯化得到高纯度的OsmC蛋白。

2.4 Mp OsmC蛋白的过氧化物酶活性测定

分别用0.25mg/mL、0.50mg/mL的Mp OsmC蛋白降解H2O2，发现两种浓度的Mp OsmC蛋白均可降解H2O2，且0.50 mg/ mL的Mp OsmC蛋白降解H2O2速度更快。

3 讨论

肺炎支原体是感染人类最常见的致病病原体。这是一种非典型的呼吸道细菌，在所有年龄段的儿童和成人中均可导致社区获得性肺炎（CAP）。自由基介导的细胞损伤是肺炎支原体影响呼吸道上皮的途径之一。氧化应激作为肺炎支原体发病机理的重要一步，由生物体产生的过氧化氢、超氧自由基以及宿主免疫系统一起产生。超氧自由基还可以通过抑制宿主细胞过氧化氢酶的产生，从而增加自由基损伤的作用。

OsmC最早在生殖支原体中发现，是细菌在面临渗透胁迫时表达的一类蛋白质，它可以分成OsmC和Ohr两大类，研究发现这种OsmC蛋白都具有抗氧化功能，在氧化过激所造成的机体损伤中均起保护性的作用。当表达OsmC的基因缺失或者人为敲除后，这些突变株或敲除株会出现强烈的氧化损伤作用，对氧化胁迫极其敏感。

本研究通过克隆肺炎支原体中的OsmC基因，并构建重组质粒诱导OsmC蛋白表达，发现高浓度的OsmC蛋白可以更多的降解H2O2，有此我们可以推断当机体受到肺炎支原体感染并损伤后，肺炎支原体中可以通过表达OsmC蛋白来减轻这种损伤。但这仅仅是我们目前所观察到的部分现象，想要进一步确证OsmC蛋白的作用，仍需过表达或者敲除OsmC基因来观察机体氧化损伤作用。本研究为探索Mp中OsmC蛋白的抗氧化机制提供了坚实的基础。

[1]孙红,孙红妹.肺炎支原体直接损伤及其免疫学致病机制研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志,2015(01):65-68.

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[3]黄海,游晓星,李冉辉.香港海鸥菌OsmC蛋白的原核表达、纯化及活性研究[J].生物技术,2015(06):535-539.

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（2016-1025）。

黄浴日，男，邵阳学院医学检验学院2015级检验二班，学号1015040216。