桑树组织培养育苗初报*

苏 伟 李茂生 陈 谷 苏茂科

(四川省三台蚕种场，四川 三台 621100)

随着桑树产业的多元化发展，各地区对优良桑苗的需求量急剧上升，而许多优良的桑品种为保持母本性状只能通过嫁接繁育，嫁接繁育成活率与嫁接技术和砧木健壮程度有很大关系，一般情况下育成一株完整的嫁接苗至少需要1年的时间，这大大影响了其推广程度。研究优质桑苗快繁技术迫在眉睫。本文以接近一年的组培试验为基础资料，现就组织培养育苗操作及优劣势进行介绍，供同仁参考。

1 桑树组织培养流程

1.1 培养材料的采集

在试验当天采取桑树品种枝条上嫩叶和新梢。

1.2 培养材料的消毒及外植体的制备

(1)先用流动水冲洗采集的培养材料，直至表面无残留污垢，用滤纸吸干水分，置于无菌操作台进行紫外灭菌30min。

(2)将桑树叶片切成约0.5cmx0.5cm的小片，新梢切成约0.5cm的小段，用75%的乙醇溶液漂洗30s后，迅速取出材料，用无菌水冲洗2次，用体积分数为5%的次氯酸钠溶液消毒8min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，得到接种所用的无菌外植体[1]。

1.3 愈伤组织诱导培养基的配置

根据王琳[2]利用组织培养技术繁育桑树无病毒苗的试验和王茜龄[3]利用桑树特异种质资源的冬芽组织培养再生植株的试验基础数据来配制培养基，MS培养基(含糖和琼脂粉)，加入无菌水，pH值保证在5.8，搅拌均匀，分别加入6-BA 溶液，2.4-D溶液，NAA溶液，KT溶液，定容后保证浓度分别为1.5mol/L、0.5mol/L、0.5mol/L、1mol/L。装瓶后在高压灭菌锅中消毒，取出试剂瓶待培养基冷却成半透明固体胶状后进行接种。

1.4 接种和初代培养

(1)接种：接种前，操作人员一定要提前进行消毒处理，避免带菌操作。在无菌坏境下，利用无菌操作台将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种3-6个。接种后，用专业封口膜口。

(2)培养条件：培养基大多应保持在25℃左右，在形成愈伤组织前不需要光照。

1.5 增殖培养

外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中。采用1/2MS培养基(含糖和琼脂)，增殖培养基内含物浓度为1mg/L 6-BA，0.25mg/L 2.4-D。在pH值5.8、温度25℃、2000lux光照12h条件下增殖培养1个月左右后，可视情况进行再增殖。

1.6 根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。将继代培养中高于1.5cm的幼苗取出，转接到1/2MS(含糖和琼脂)生根培养基中,内含物浓度为0.75mg/L 6-BA，0.25mg/L 2.4-D，1.5mg/L NAA。pH值、温度、光照条件同上述增殖培养参数，1个月后即可获得键壮根系。

1.7 组培苗的练苗移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3d，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度(相对湿度98%左右)，但基质不宜过湿，以防烂苗。

2 操作注意事项

2.1 接种室的消毒

植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术,做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子,因此,每次接种前应进行地面的清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降,并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜,以延长使用寿命。

2.2 无菌操作要求

工作人员使用的工作服、帽子、口罩等,要经常保持干净,并定期进行消毒,即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌,为此要穿上工作服,戴上帽子,也必须剪除指甲,并用肥皂擦洗,最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min,接种操作前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染,主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的,因此,在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。

2.3 材料的分离、切取和接种

切割动作要快,防止挤压使材料受损伤而招致培养失败,也要避免使用生锈的刀片,以防止氧化现象产生。接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%酒精中浸泡,然后灼烧放凉备用。

接种时轻轻取下封口纸,动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口靠近酒精灯火焰,瓶口倾斜,以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,将灰尘杂物等固定在原处,然后用镊子将外植体送入瓶中,材料在培养容器内的分布要均匀,以保证必要的营养面积和光照条件。

3 组培的优势

(1)繁殖速度快、繁殖系数大用试管快繁技术繁殖, 可节约繁殖材料，只取原材料上的一小块组织或器官就能在短期内生产出大量市场所需的优质苗木, 每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株，既不损伤原材料又可获得较高的经济效益。

(2)繁殖方式多有短枝扦插、芽增殖、原球茎、器官分化和胚状体发生。

(3)繁殖后代整齐一致,能保持原有品种的优良性状 试管繁殖是一种微型的无性繁殖,它取材于同一个体的体细胞而不是性细胞,因此其后代遗传性非常一致,能保持原有品种的优良性状。对保质、保纯有着特殊作用。可获得大量的统一规格、高质量的桑苗，桑苗商品性好。

(4)可获得无毒苗 采用茎尖培养的方法或结合热处理除去绝大数植物的病毒、真菌和细菌，使植株生长势强、色泽鲜艳、抗逆能力提高。

(5)可进行周年工厂化生产 、经济效益高试管快繁是在人工控制的条件下进行的集约化生产,不受自然环境中季节和恶劣天气的影响。所以不受季节限制，可以全年进行连续生产, 生产效率高。从取材→接种→培养→生根→移栽，可像工厂化一样生产，所以这一技术在农业上的应用被称为是农业上的一次“革命”。对反季节生产有着特殊作。

4 存在的问题

(1)基础设施缺乏由于组织培养对于基础设施条件要求较高，现目前许多单位都不具备硬件设施，导致开展起来有一定难度，特别是对于培养基的灭菌以及接种无菌操作。组织培养对于无菌环境要求较高，在培养的任何一个环节出现问题都会导致试验的失败。即加大硬件设施的建设，完善相关的仪器设备对开展基础科学试验是很有必要的。

(2)专业人员水平薄弱组织培养需要熟悉相关操作且掌握此类专业知识的专业技术人员，由于缺少这样的专业技术人员或者专业人员理论水平薄弱，即使在有条件的情况下也没法进行组织培养育苗。所以加大对专技人员的继续教育和培训有助于提高整体的创造力和技术水平。

(3)成本偏高、风险高对于传统育苗来说，一株成型的嫁接苗成本大约在5-8角之间，而组织培养育苗，除去基础设施建设，仅仅算上组培药物成本、人力成本、水电成本以及移栽成本，一株桑苗成本基本在4-5元左右，成本接近传统育苗的10倍。高成本费用对于桑苗这种市面经济价值不高的苗木来说并不划算。组织培养对于灭菌要求很严格，若是不小心染菌，培养材料则会污染作废，对其是必是致命的打击，所以组织培养对平时的操作要求和环境消毒很严格，存在一定风险性。

(4)移栽苗生长前期处于弱势桑苗属于木本植物，相比草本植物不易培养，且从培养瓶中组培生产的苗初次移栽到大田中，前期有一段适应期，适应期期间普遍抗逆性都没有传统扩繁的桑苗强，长势较弱，前期生长较慢，易死亡，存活率不高。

5 讨论

根据以往桑苗组织培养试验数据来看，综合分析对比组织培养优缺点，可见组织培养虽能保存母本优良性状，培养无毒苗，但是成本和技术要求颇高。组织培养在桑树苗木产业化上暂时存在部分问题，但是潜力巨大。同时组织培养在稀缺桑品种资源保存方面可以发挥优势，扩繁稀有品种，保存稀缺资源和维持品种多样性。并且植物组织培养对于从细胞多倍体方向研发新品种[4]也有至关重要的作用。

[1] 谈建中. 桑树组织培养研究综述[J]. 江苏蚕业,1991,13(4):1-6.

[2] 王琳. 利用组织培养技术繁育桑树无病毒苗的试验[J].蚕业科学，2013,39(4)：643-649.

[3] 王茜龄.利用桑树特异种质资源的冬芽组织培养再生植株的试验[J].蚕业科学,2012,38(5)：924-929.

[4] 王茜龄. 桑树组织培养诱导多倍体植株[J].林业科学,2008,44(6)：164-167.