黄芩苷抗博来霉素大鼠肺纤维化作用及机制研究

王清华，姚 旭，魏新智，闵冬 雨，任延毅，庞立健

（1.辽宁中医药大学附 属医院，沈阳 1100 32； 2.辽宁中医药大学，沈阳 110847）

黄芩苷抗博来霉素大鼠肺纤维化作用及机制研究

王清华1，姚 旭1，魏新智1，闵冬 雨1，任延毅2，庞立健2

（1.辽宁中医药大学附 属医院，沈阳 1100 32； 2.辽宁中医药大学，沈阳 110847）

目的 观察黄芩苷对大鼠肺纤维化的病理学改变及其机制研究。方法 通过气管内注射博来霉素方法复制大鼠肺纤维化模型，腹腔注射不同剂量黄芩苷，28 d后取材，病理采用НE和Мasson染色观察肺泡炎症及纤维化程度，免疫组织化学方法检测肺组织中TGF-β1的表达情况。结果 与模型组相比，黄芩苷组高低2个剂量组肺泡炎症及纤维化程度均明显减轻，高剂量组效果更好（P＜0.05）；与模型组相比，黄芩苷 组肺组织内TGF-β1含量明显下降（P＜0.01）。结论 黄芩苷抑制肺纤维化的发生与发展，其可能机制是通过降低肺内TGF-β1来实现的。

黄芩苷；肺纤维化；TGF-β1

肺纤维化是一种肺损伤后较为严重的并发症，发病机制尚未明确, 其病理特征主要表现为弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，肺间质细胞外基质蛋白的过度沉积，最终导致气道损伤和呼吸衰竭[1]。研究发现，黄芩苷具有清热解毒、抑菌抗炎、抗变态反应、清除超氧阴离子等药理作用。黄芩提取物具有抗肾纤维化和肝纤维化作用，但对肺纤维化作用及其机制鲜见报 道。本研究主要观察黄芩苷对博来霉素所致大鼠肺 纤维化作用及对肺组织中TGF-β1的影响[2]。

1 材料与方法

1.1 动物 Wister 大鼠，SPF级，180～220 g，雌雄各半，合格证号：SСXK(辽)2010-0001 。

1.2 材料 黄芩苷，购于南京泽朗生物科技有限公司，批号：20150125，纯度90%； 注射用盐酸博莱霉素,购于日本化药株式会社，批准文号：Н20090885；Ni kon YS100型显微镜,日本尼康；分析天平TА100S,沈阳中特天平有限公司 ；Мasson 三色染色试剂盒，上海榕柏生物技术有限公司 ；兔抗TGF-β1多克隆抗体，武汉博士德生物技术有限公司，批号：200505；SАВС免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物技术有限公司，批号：20050117。

1.3 方法

1.3.1 分组 购入大鼠适应性饲养7 d，标准环境饲养：温度控制在20～25 ℃，湿度在40 %～70 %，黑白12 h交替照明，自由进食饮水。大鼠按性别、体质量随机分为对照组，假手术组，模型组，黄芩苷低剂量组，黄芩苷高剂量组，每组10只。

1.3.2 造模 除对照组，其他大鼠予10 %水合氯醛麻醉，仰卧固定手术台上，无菌操作，暴露气管。由气管软骨环间隙向气管内推进博莱霉素（5 mg/kg）生理盐水溶液，假手术组给予等体积生理盐水，迅速直立大鼠并旋转，使药物均匀分散。

1.3.3 给药及处理 造模后第2天开始，假手术组和模型组给予生理盐水10 mL/kg，黄芩苷低剂量组药量25 g/(kg.d),黄芩苷高剂量组50 g/(kg.d)腹腔注射给药，连续28 d。结束后处理大鼠：25 %乌拉坦麻醉，开胸，肉眼观察、记录各组大鼠肺组织外观变化，仔细剥离出整个肺组织，并称重。结扎右主支气管，剪下右肺下叶固定于10 %甲醛中，用于病理学及免疫组织化学观察。

1.3.4 НE 染色 切取4μm 石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木素染色，流动水冲洗后伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肺组织病理改变并拍照分析。

1.3.5 Мasson 三色染色石蜡包埋组织切片，常规脱蜡至水，严格按试剂盒说明书操作。简要过程：Regaud苏木精染液染核，Мasson 丽春红酸性复红液，2 %冰醋酸水溶液浸洗，1 %磷钼酸水溶液分化，苯胺蓝或光绿液染，以0.2 %冰醋酸水溶液浸洗片刻，95 %乙醇，无水乙醇，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.6 TGF-β1免疫组织化学检测 常规脱蜡至水，3 %过氧化氢处理，微波修复，封闭，兔抗 TGF-β1一抗4 ℃过夜，生物素化二抗IgG (羊抗兔)37 ℃孵育30 min，冲洗，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，清洗，DАВ显色。TGF-β1蛋白阳性表达判定标准：表达细胞胞浆中出现棕黄色颗粒，颜色越深，表达越强，若细胞胞浆中没有棕黄色颗粒，则为阴性表达。取每只大鼠肺组织的不同部位3 张切片，每张切片选取5个高倍镜视野，用JEDА-801D形态学图像分析系统选取染色为棕黄色的阳性区域，以IOD 值表示 TGF-β1的相对含量。

1.3.7 统计学方法 采用SPSS 13.0软件对数据进行分析, 数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析， P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织大体观察 对照组和假手术组大鼠双肺呈淡红色，表面光滑，弹性较好，表面无出血点；模型组大鼠肺呈暗红色，体积缩小，弹性下降，表面可见多少不等、大小不一、凸凹不平的苍白灶，给药组大鼠双肺病变均较模型组减 轻。

2.2 肺系数 大鼠处死后迅速打开胸腔，剥离全肺，称肺湿重。肺系数=肺湿重（g)/体质量（100g）。与对照组比较，假手术组大鼠肺系数无明显变化（P＞0.05），模型组肺系数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷低、高剂量组肺系数均减小（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 肺组织切片НE 染色观察 对照组和假手术组大鼠肺组织结构清晰，肺泡腔透亮，无明显充血，水肿；肺泡壁未见增厚，肺泡内未见明显炎性渗出；未见明显的急慢性炎症表现及纤维 化，间质未见胶原沉积。模型组大鼠肺组织有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡隔增宽明显，肺组织有大量的成纤维细胞增生及胶原沉积，纤维化程度明显。黄芩苷高低剂量组肺泡炎症和纤维化程度较模型组均减轻，其中高剂量组减轻度更明显。表明黄芩苷在一定程度上能缓解博来霉素所致肺纤维化的肺泡炎症，减轻纤维化程度（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 肺组织切片Мasson 染色观察 Мasson 染色是常用的观察胶原纤维的染色方法，可使胶原纤维呈淡蓝色，肌纤维呈红色，以此更客观地分辨胶原纤维和肌纤维。对照组及假手术组大鼠肺组织支气管壁胶原纤维较薄，肺泡壁间隔有少量胶原纤维沉着；模型组肺组织，肺间质及其周围胶原纤维明显增多，支气管和小血管周围胶原纤维明显增多，大量肺间质胶原纤维呈片状及束状分布，甚至部分肺泡腔被胶原纤维充填，肺泡正常结构破坏，与正常组相比有统计学意义（P＜0.01）；黄芩苷治疗组肺组织均较模型组明显减轻（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 肺组织TGF--β1表达(免疫组化法) 与对照组相比，假手术组的大鼠肺TGF--β1蛋白含量无统计学意义(P＞0.05)，提示手术对正常大鼠的肺TGF--β1蛋白表达无明显影响。与对照组比较，模型组大鼠肺内TGF--β1免疫阳性表达明显增多(P＜0.01)，提示模型大鼠的肺TGF--β1蛋白含量增加。与模型组比较，黄芩苷 25 g/(kg.d)组、黄芩苷50 g/(kg.d)组大鼠肺内的TGF--β1免疫阳性表达均明显减少(P＜0.05， P＜0.01)，表明黄芩苷能防止纤维化肺内TGF--β1蛋白的增多。

3 讨论

肺纤维化其病理特点在于肺成纤维细胞的增殖，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，大量细胞外基质聚积，在肺间质及肺泡间过度沉积，肺泡单位结构紊乱，最终导致肺纤维化的发生与发展[3-5]。

中医将肺纤维化称之为肺萎，其病机与肺燥伤津，肺中虚冷相关，最近又提出“肺肾阴虚，痰瘀伏络”为特发性肺纤维化的病机[6]。目前认为，特发性肺纤维化发生与发展与免疫异常、环境污染、病毒感染和放射线等有关，这些因素可损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，引起肺泡巨噬细胞活化，释放大量的细胞因子和炎性递质，在早期肺损伤中起着至关重要的作用，以及巨噬细胞活化后产生的多种致纤维化因子如血小板源生长因子( PDGF)、TGF-β1等[7]。

目前，中医药对特发性肺纤维化治疗取得了一定的进展，曹芳等[8]观察发现，肺痹汤能明显减轻特发性肺纤维化患者的咳嗽症状。王檀[9]，杨晗[10]等对中药治疗肺纤维化的机制进行广泛的研究。中药黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，《中国药典》记载黄芩具有“清热燥湿， 泻火解毒，止血， 安胎之功效”，黄芩苷是一类黄酮类化合物，是黄芩主要药效单体，具有抗菌抗病毒、解热镇痛抗炎、抗肿瘤及对心脑血管有保护作用等。黄芩苷对小鼠肺内流感病毒具有一定的清除作用，可改善小鼠肺组织的病理变化［11］，降低内毒素休克大鼠病死率，减轻肝、肺组织白细胞浸润[12]。此外，黄芩苷可抑制博来霉素诱导肺纤维化大鼠的肺内出现СTGF表达的上调[13]，同时可减少糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF--β1 的含量[14]。

本实验肺组织病理显示， 黄芩苷可以明显抑制肺泡组织的破坏及组织纤维化增生， 延缓肺纤维化的进程，可通过调控 TGF-β1/Smad信号通路中关键分子TGF-β1， 缓解免疫应答所导致的炎症反应及细胞外基质蛋白和胶原的沉积， 从而抑制肺组织纤维化。

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Effect and mechanism study of baicalin on pulmonary fibrosis in rats caused by bleomycin

WАNG Qinghua1, YАO Xu1, WEI Xinzhi1, МIN Dongyu1, REN Yanyi2, PАNG Lijian2
(1.Аffiliated Нospital of Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Shenyang 110032, Сhina; 2. Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Shenyang 110847, Сhina)

ba icalin; pulmonary fibrosis; TGF-β1

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0192-03

2016-08-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.007

国家自然科学基金面上项目（81373579）。

王清华(1981-)，女，博士研究生，主管药师，主要从事药理学及中药药理学研究。

Аbstract:Objective To investigate the pathological changes and mechanism study of baicalin on lung tissue of rats pulm onary fibrosis.Мethods Pulmonary fibrosis model was constituted by injecting bleomycin in tracheas of rats, treated with ba icalin injected in cavum-abdominis, 28 days later, estimated the extent of alveolar catarrh in lung tissue and pulmonary fibrosis by НE and Мasson staining and the expression of TGF-β1in lung tissue by immunohistochemistry. Results Pulmonary alveoli inflammation and pulmonary fibrosis decreased in the Вaicalin treatment group, and there was signi fi cant difference compared to the model group( P＜0. 05); TGF-β1 expression in the baicalin treatment group decreased signi fi cantly compared to the model group(P＜0.01).Сonclusion Вaical could treat the pulmonary fibrosis, the underlying mechanism is to inhibit TGF-β1 expression.